miR-146a在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中表達及意義

張 凡，曹峰林，李俊儒，孫國勛*

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 血液風(fēng)濕科,黑龍江 哈爾濱150001; 2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血液科,黑龍江 哈爾濱150001)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是常見的慢性、系統(tǒng)性的自身免疫性疾病。特征是產(chǎn)生自身抗體，形成免疫復(fù)合物沉積于組織器官形成炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致多器官組織損傷，包括皮膚、腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、肺臟、骨骼肌和胃腸道系統(tǒng)的紊亂，是影響人類健康的重要風(fēng)濕病之一。因此，正確診斷非常重要。但直到目前為止，該病的診斷仍無標(biāo)準(zhǔn)，臨床只能根據(jù)分類標(biāo)準(zhǔn)進行診斷。另外，早期診斷和早期治療對系統(tǒng)性紅斑狼瘡的預(yù)后極其重要[1-3]。

MicroRNA(miRNA)是真核生物中一類長度19至25個核苷酸組成的RNA，它是由60至110個核苷酸組成的前體miRNA經(jīng)Dicer酶加工而來。miRNA通過堿基配對與靶mRNA序列的3’UTR區(qū)域結(jié)合，抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控基因的表達，參與細胞分化、細胞增殖、細胞之間的相互作用及細胞信號通路的調(diào)節(jié)[4]。miRNA還參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，包括心血管疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等[5]。近年研究表明，miRNA在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[6]。血清中的miRNA性質(zhì)穩(wěn)定，目前已經(jīng)在惡性腫瘤、心血管疾病、代謝性疾病等多種疾病中發(fā)現(xiàn)有特異的表達譜，可以用于這些疾病的診斷[7,8]。

本研究應(yīng)用實時定量PCR(Q-RT-PCR)檢測SLE患者血清中miR-146a的表達，與健康對照組相比，SLE患者血清中miR-146a明顯降低。分析表明，SLE患者血清中miR-146a表達與患者血沉和C反應(yīng)蛋白呈負相關(guān)，與補體水平呈正相關(guān)。這些結(jié)果提示血清中miR-146a不僅可以用于SLE的診斷，而且還可能與疾病活動相關(guān)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

SLE患者22例。符合1997年美國風(fēng)濕學(xué)會(ARA)修訂的分類標(biāo)準(zhǔn)，均為女性，年齡為22-58歲。正常對照組20例，均為來自健康體檢女性，年齡22-58歲，組間性別和年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 miRNA的提取和純化

用mirVanaPARIS Kit(美國Ambion公司)提取和純化miRNA，血清500 μl室溫下加入1倍體積的denaturing solution，充分混勻，加入1 ml酚氯仿，渦旋震蕩30-60 s， 14 000 r/min離心5 min，取上清液，加入 1.25倍體積的無水乙醇,充分混勻，將混合液加入到柱子中，12 000 r/min離心30 s，棄濾液，柱中加入700 μl wash solution 1，12 000 r/min離心30 s，棄濾液，柱中加入500 μl wash solution 2/3，12 000 r/min離心30 s，棄濾液，重復(fù)500 μl wash solution 2/3，12000 r/min離心30 s，棄濾液，12 000 r/min離心1 min，加 60 μl 95℃預(yù)熱的elution solution到柱中，12000 r/min離心1 min，收集 miRNA。紫外分光光度儀檢測 miRNA濃度和質(zhì)量，-80℃冰箱凍存。

1.3 cDNA的合成

用TaqManTMMicroRNA Reverse Transcription Kit (美國ABI公司)將提取的miRNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，按說明書將5 μl miRNA加入反應(yīng)體系中：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min；U6逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件：37℃30 min，85℃5 min，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保持在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 Q-RT-PCR

取1 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，用TaqManTMUniversal PCR Master Mix(美國ABI公司)進行Q-RT-PCR。反應(yīng)體系20 μl，含逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μl,2×Master mix10 μl，PCRprimer0.5 μl，20×SYBRIlμl,H2O7.5 μl。反應(yīng)條件：95℃10 min，然后95℃15 s，60℃1 min 40個循環(huán)。在 ABI7300型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)上進行實時熒光定量PCR。U6作為內(nèi)參，結(jié)果計算用2-△CT方法，引物序列見表1。

表1 miR-146a和U6引物序列

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 SPSS13.0軟件包進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，患者與健康對照組進行t檢驗，用Pearson相關(guān)系數(shù)分析血清中miR-146a相對表達水平變量與紅細胞沉降率(ESR)、C反應(yīng)蛋白(CRP)和補體變量之間的相關(guān)性。P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清中miR-146a的相對表達水平

與健康對照組相比較，SLE患者血清中miR-146a相對表達水平降低(P=0.024),如圖1所示。

2.2 SLE患者血清中miR-146a表達水平與ESR、CRP、補體C3和補體C4的相關(guān)性

SLE患者血清中miR-146a表達水平與ESR呈負相關(guān)(r=-0.464，P=0.030)，與CRP呈負相關(guān) (r=-0.525，P=0.012)，見圖2。SLE患者血清中miR-146a表達水平與補體C3呈正相關(guān)(r=0.487，P=0.021)，與補體C4呈正相關(guān)(r=0.580，P=0.005)，見圖3。

圖1 SLE患者血清miR-146a相對表達水平的變化

圖2 SLE患者血清miR-146a表達水平與血沉和C反應(yīng)蛋白相關(guān)性分析

圖3 SLE患者血清miR-146a表達水平與補體C3和補體C4相關(guān)性分析

2.3 血清中miR-146a診斷SLE的性能

血清miR-146a診斷SLE的ROC曲線下面積為0.691(P=0.034)，診斷敏感度為63.64%，特異度為75%，見圖4。

圖4 ROC曲線下面積

3 討論

SLE是一種自身免疫性疾病，發(fā)病機制尚不清楚。由于SLE缺乏特異性臨床表現(xiàn)，因此早期診斷較為困難，常出現(xiàn)漏診或誤診[1]。糖皮質(zhì)激素是治療SLE最常用藥物，但部分患者病情不能得到有效控制。此外，糖皮質(zhì)激素有嚴(yán)重的副作用。因此，發(fā)現(xiàn)SLE的生物標(biāo)志物和治療靶點具有重要的臨床意義。

miRNA是一類包含19-25個核苷酸的單鏈非編碼小RNA分子。通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達，參與細胞增殖、凋亡、分化、代謝、死亡等生物過程。miRNA的轉(zhuǎn)錄改變在人體生理病理過程中發(fā)揮重要作用，影響靶基因的表達[9]。一些研究發(fā)現(xiàn)SLE患者血漿、PBMC、和特定細胞中miRNA表達異常[10]。多項研究發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血單個核細胞(PBMC)中miR-146a表達降低[11-13]，Wang等研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者血清中miR-146a表達降低，并且與患者C反應(yīng)蛋白相關(guān)[14]，而尹志華等研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者血清中miR-146a的表達水平有下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義[15]。本研究結(jié)果顯示，SLE患者血清中miR-146a表達明顯低于健康對照組。此外，miR-146a表達的降低與患者血沉和C反應(yīng)蛋白呈正相關(guān)，與補體水平呈負相關(guān),血清miR-146a ROC曲線下面積為0.691，診斷敏感度為63.64%，特異度為75%,表明miR-146a不僅與SLE的活動相關(guān)，還可以作為標(biāo)志物用于SLE的診斷。

選擇血清作為標(biāo)本，操作方便，患者更容易接受。miRNA在血清中的相對表達可以反映SLE的變化，可以持續(xù)監(jiān)測。