酪酸梭菌二聯(lián)活菌對晚期早產(chǎn)兒外周血T細胞表達CD28和PD-1的影響及臨床意義

鄭雨微，唐宗生，陶雨琦，方 玢，張士發(fā)*

(1.皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院 兒科，安徽 蕪湖241001；2.皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院 輸血科，安徽 蕪湖241001)

晚期早產(chǎn)兒是指孕周為340/7～366/7的早產(chǎn)兒，占早產(chǎn)兒的大部分。與足月兒相比，晚期早產(chǎn)兒免疫系統(tǒng)功能尚不完善，黃疸、喂養(yǎng)困難、呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生率明顯升高，腸道定植菌也有所不同[1]。益生菌制劑的應用，可以有效的改善晚期早產(chǎn)兒早期腸道定植菌，促進腸道功能的穩(wěn)定。目前發(fā)現(xiàn)，早期定植菌種類與成長過程中一些疾病發(fā)生如哮喘、急性胃腸道炎、腹瀉、肥胖等有一定關(guān)系[2,3]。雖然目前有較多關(guān)于新生兒使用益生菌調(diào)節(jié)劑后免疫系統(tǒng)改變的研究，但是具體的機制尚不清楚。PD-1作為一種免疫抑制信號分子，可以有效調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫應答反應。有研究表明，改變腸道菌群后，可以改善PD-1抑制劑療效，減輕病人的癥狀[4]。在使用PD-1抑制劑治療癌癥時，增殖的主要是CD28+CD8+T細胞[5]。CD28是一種免疫刺激性分子，主要刺激T細胞活化、增值、分化。所以我們設(shè)計了這個實驗，觀察晚期早產(chǎn)兒使用益生菌制劑—酪酸梭菌二聯(lián)活菌前后，T細胞表面PD-1和CD28表達變化，從而進一步探討益生菌調(diào)節(jié)晚期早產(chǎn)兒免疫系統(tǒng)的機制，為臨床運用益生菌制劑治療晚期早產(chǎn)兒提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究對象及納排標準

選取皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院2015.06至2017.01收治入新生兒重癥監(jiān)護室的晚期早產(chǎn)兒(34周≤孕周<37)40人，按隨機分組法均分為對照組和實驗組，每組20人。最終有35例完成實驗(對照組18例，實驗組17例)，5例退出實驗(提前出院2例，實驗期間服用抗生素2例，標本量過少1例)。實驗組：將酪酸梭菌二聯(lián)活菌210 mg(科興生物公司提供，420 mg藥粉/粒，有效期內(nèi)含酪酸梭菌活菌不低于1.0×10^7cFu/g，含雙歧桿菌活菌粉不低于1.0×10^6cFu/g)溶于奶粉溶液，給患兒口服，一日兩次；對照組：服用相同劑量的奶粉溶液。持續(xù)7天。實驗和對照組在出生體重、性別、年齡、分娩方式方面無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。此次研究納入標準：母孕期無感染、胎膜早破、免疫疾病，晚期早產(chǎn)兒無窒息、宮內(nèi)感染、服用抗生素。實驗經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，并獲得患者家屬知情同意。

1.2 實驗主要試劑與儀器

Anti-Human CD3-ECD(美國Beckman公司)、Anti-Human CD4-PC5 (美國eBioscience公司)、Anti-Human CD8-PC7 (美國Beckman公司)、Anti-Human PD-1-FITC和Isotype抗體(美國Biolegend公司)、Anti-Human CD28-PE和Isotype抗體 (美國eBioscience公司)、人淋巴細胞細胞分離液(天津灝洋生物制品公司)、PBS緩沖液 (北京Thermo公司)、FC500 MPL流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)。

1.3 標本采集與檢測

1.3.1標本采集 分別在入院24 h內(nèi)及干預7天后，抽取患兒外周靜脈血1 ml，EDTA抗凝管保存待檢。

1.3.2PBMC分離 將1 ml標本用0.9%氯化鈉溶液稀釋一倍，再用1 ml加樣槍緩慢疊加到有3 ml淋巴細胞分離液的15 ml離心管中，2 000 rpm×20 min離心；小心抽吸離心后中間的白膜層，置于15 ml離心管中；再于離心管中加入8 ml 1640細胞培養(yǎng)液，2 000 rpm×10 min離心；棄上清，加PBS至10 ml刻度，再次2 000 rpm×10 min離心：棄上清，加入1 ml PBS，渦旋，配成細胞懸液。

1.3.3流式檢測 取2只流式管標號為1、2，1號管中依次加入3 μl熒光標記抗體CD3 -ECD、CD4-PC5、CD8-PC7、PD-1-FITC、CD28-PE,2號管加入CD3-ECD、CD4-PC5、CD8-PC7、PD-1 Isotype、CD28 Isotype各3 μl；每管加入再懸好的淋巴細胞200 μl，震蕩，室溫避光孵育30 min；1500 rpm×5 min離心，棄上清；加入500 μl PBS，震蕩，流式細胞儀檢測。

1.3.4生化檢查 入院24 h內(nèi)抽取患兒外周靜脈血2 ml，送檢驗科進行生化檢查：白蛋白、球蛋白、總蛋白含量。

1.4 統(tǒng)計學分析

流式實驗結(jié)果使用Flowjo(7.6)軟件分析。CD4+與CD8+T細胞上PD-1和CD28表達采用平均熒光強度(MFI)表示。所得數(shù)據(jù)采用Graphpad prism(6.0)軟件分析。 Wilcoxon 配對檢驗比較組內(nèi)干預前后的差異；MannWhitney U 檢驗用于比較不同兩組間的區(qū)別；Spearman檢驗用于相關(guān)性分析。以α<0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 酪酸梭菌二聯(lián)活菌治療對晚期早產(chǎn)兒外周血CD8+T細胞表達PD-1和CD28的影響

圖1A表示CD8+T細胞表面表達的PD-1及Isotype的流式散點圖；相對對照組，實驗組在干預后，CD8+T細胞上PD-1表達更高 (P=0.0262)，見圖1B，但CD28無明顯改變(P=0.2619)，見圖1C。

圖1 CD8+ T細胞表面PD-1和CD28表達狀況

2.2 酪酸梭菌二聯(lián)活菌治療對晚期早產(chǎn)兒外周血CD4+T細胞表達PD-1和CD28的影響

流式直方圖表示實驗組干預前后PD-1(見圖2A)和CD28(見圖2B)在CD4+ T細胞表面表達狀況；相對于對照組，實驗組在干預前后，其CD4+T 細胞PD-1的表達的下降幅度(治療后與治療前的比值)和CD28的表達的上升幅度均顯著增高 (P=0.0318；P=0.0038)，分別見圖2C、 2D。

圖2 CD4+ T細胞表面PD-1和CD28表達的變化幅度

2.3 晚期早產(chǎn)兒外周血CD8+T 細胞PD-1和CD28表達與臨床指標相關(guān)性

干預前，所有晚期早產(chǎn)兒(對照組和實驗組)CD8+T細胞 PD-1表達的MFI與其血清白蛋白呈負相關(guān) (r=-0.5097，P=0.0018)，見圖3A；干預前，所有晚期早產(chǎn)兒CD8+T 細胞CD28表達的MFI與其血清球蛋白成正相關(guān) (r=0.5699，P=0.0004)，見圖3B。

圖3 PD-1、CD28與臨床指標的相關(guān)性

3 討論

早產(chǎn)兒早期腸道微生物的定植有利于維護腸道粘膜屏障功能的穩(wěn)定，可產(chǎn)生抗病原微生物物質(zhì)，減少腸道致病菌的感染。當腸道菌群失調(diào)時可以導致如腹瀉、營養(yǎng)不良，甚至可能與后期哮喘、炎癥性腸病有關(guān)[6]。益生菌是對人體有益的微生物，常用于腸道功能紊亂疾病的治療[7]，與人體免疫系統(tǒng)的功能有一定關(guān)系。一個穩(wěn)定的免疫系統(tǒng)對機體健康有很大影響，當機體免疫功能低下時，容易發(fā)生感染性疾?。欢斆庖吖δ苓^強時，自身免疫病的發(fā)生率又會有所提高。T細胞主要與機體的細胞免疫相關(guān)，其活化時不僅需要抗原提呈細胞(Antigen Presenting Cells,APC)提供主要組織相容性復合體(Major Histocompatibility Complex,MHC)為第一活化信號，同時還需要協(xié)同刺激信號分子的激活提供的第二活化信號。其中PD-1就是一種抑制性信號分子，可以抑制T細胞的活化。PD-1不僅僅在T細胞表面表達，在B細胞、骨髓細胞等都有所表達，在免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮非常廣泛作用。CD28則是一種刺激性信號分子，在95% CD4+T細胞和50% CD8+T細胞上表達，可以降低T細胞活化閾值[8]。

有研究發(fā)現(xiàn)在慢性感染、腫瘤患者體內(nèi)PD-1及其配體持續(xù)高表達，使T細胞功能耗竭，當使用阻斷PD-1信號通路藥物時，可以顯著的減輕患者的癥狀[9]，說明PD-1高表達對T細胞活化有抑制作用，從而影響了機體的免疫應答。Routy[4]等人進一步報道，原本對PD-1通路抑制劑效果不佳的腫瘤患者在口服益生菌之后，臨床癥狀明顯改善。益生菌可能通過調(diào)節(jié)其腸道微生物構(gòu)成，抑制了PD-1信號通路，最終調(diào)控機體免疫應答反應。在Kamphorst Alice O的研究中也發(fā)現(xiàn)，基因工程技術(shù)敲除CD28基因或使用抗體阻斷CD28表達的小鼠，T細胞不能對PD-1抑制劑產(chǎn)生有效反應實現(xiàn)增殖[5]，說明CD28對PD-1信號通路發(fā)揮作用也存在一定影響。本研究發(fā)現(xiàn)，相對于對照組，口服酪酸梭菌二聯(lián)活菌可以使晚期早產(chǎn)兒外周血CD8+T細胞上PD-1表達升高，而CD28表達沒有顯著變化。這個結(jié)果表明：口服酪酸梭菌二聯(lián)活菌能夠有效抑制晚期早產(chǎn)兒外周循環(huán)血CD8+T細胞的活化。同時我們發(fā)現(xiàn)，相對于對照組，實驗組CD4+T 細胞PD-1的表達的下降幅度(治療后與治療前的比值)和CD28的表達的上升幅度更大。因此我們認為，相對于單純的奶粉溶液，口服酪酸梭菌二聯(lián)活菌能夠有效加快晚期早產(chǎn)兒外周循環(huán)血CD4+T細胞的活化速度。益生菌作為一種外來微生物，可以刺激機體產(chǎn)生免疫應答，研究表明服用益生菌可以促進CD4+T細胞活化，充分發(fā)揮機體免疫功能[10,11]。所以我們推測酪酸梭菌二聯(lián)活菌可能通過調(diào)節(jié)CD28 和PD-1分別在CD4+T細胞的高、低表達，及PD-1在CD8+T細胞的高表達，最終影響和調(diào)節(jié)晚期早產(chǎn)兒免疫功能。此結(jié)果表明：相對于CD8+T細胞，酪酸梭菌二聯(lián)活菌治療更有益于促進CD4+T細胞的活化；CD8+T細胞受到PD-1調(diào)控，而不至于活化過度。CD8+T主要是細胞毒性T淋巴細胞，是細胞免疫的主要細胞，具有細胞毒作用，可以特異性殺傷靶細胞[12]。這也與我們之前口服益生菌對抑制性分子B、T淋巴細胞弱化因子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)影響的研究結(jié)果一致，口服益生菌后，可以促進BTLA在CD8+ T細胞上的表達，從而抑制CD8+T細胞的過度活化[13]。

白蛋白是人體內(nèi)數(shù)量最多的蛋白質(zhì)，蛋白分子量較小，所以在體內(nèi)主要起運輸和維持血漿滲透壓的作用[14]，在臨床中也可應用于疾病治療的療效評價，如川崎病、格林-巴利綜合征免疫球蛋白治療效果[15,16]。有研究表明，對于自身免疫性腦炎患者，白蛋白低的患者免疫抑制治療效果相對而言不佳，沒有白蛋白高患者對治療敏感性高[17]。晚期早產(chǎn)兒的免疫系統(tǒng)尚未成熟，更容易導致各種病原體的感染，當白蛋白水平較高時，其感染的概率低，同時預后也更加良好[18]。我們發(fā)現(xiàn)，所有患兒在治療前CD8+T細胞PD-1表達與白蛋白表達是一種負性關(guān)系(r= -0.502，P=0.0147)，CD28與球蛋白表達是一種正性相關(guān)(r=0.5699，P=0.0004) 的關(guān)系。說明CD8+T細胞PD-1和CD28均是判斷晚期早產(chǎn)兒的免疫功能的敏感指標。其臨床意義有待進一步的深入研究。此外，當CD28與B7結(jié)合后，可以促進CD40L的表達，使B細胞增殖分化，調(diào)節(jié)免疫球蛋白的類型轉(zhuǎn)換，同時使B細胞對Fasl介導的凋亡易感性減低，與B細胞抗體的形成有一定關(guān)系。球蛋白是人體內(nèi)的各種抗體總和，具有免疫作用，可以抵抗病原體感染，減少疾病的發(fā)生。這給我們提供一些參考作用，當PD-1表達升高、CD28表達降低時，要注意提防晚期早產(chǎn)兒可能發(fā)生感染性疾病。

當然本研究還有一些不足之處，由于晚期早產(chǎn)兒抽血困難，配合度不是特別高，也導致了我們樣本量可能不能完全滿足要求。

綜上所述，我們認為益生菌可能通過影響T細胞上CD28，PD-1分子表達來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能，在促進T細胞活化的同時，也會防止T細胞的過度活化。白蛋白和球蛋白與免疫細胞的活化程度存在一定的相關(guān)性。總之，將T細胞表面的信號分子的表達狀況與臨床常用指標進行綜合研究，可為我們將來在科研實踐、評價患者療效及預后方面提供一定的參考。