α-突觸核蛋白對小鼠BV2細胞凋亡的影響及司來吉蘭的干預作用

高 宇,沈 靜,宋蓮蓮,南光賢*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 神經內科,吉林 長春130033;2.吉林省中醫藥科學院)

α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)是由 140 個氨基酸構成的小分子蛋白質，在正常情況下主要以可溶性的單體形式存在于神經元[1]。然而，α-Syn 的代謝發生障礙，使其在神經細胞內異常積聚，進而聚集成纖維而以包涵體的形式沉積在神經細胞內[2]，形成突觸核蛋白病(α-synucleinopathy)包括帕金森病路易體癡呆(dementia with Lewy bodies，DLB)及多系統萎縮(multiple system atrophy，MSA)的標志性病理改變。細胞凋亡是由機體內外因素觸發細胞內預存的死亡程序而導致細胞死亡的過程，凋亡異常往往引起多種疾病,如癌癥、自身免疫性疾病、神經退行性疾病等[3]。因此，本研究將利用小鼠BV2 神經膠質細胞株，通過體外研究技術，研究α-Syn寡聚體 對小鼠BV2 神經膠質細胞凋亡的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BV2細胞購自于武漢普諾賽生命科技有限公司,MEM 培養基購自于美國 Hyclone 公司;胎牛血清由元亨生物科技有限公司提供； DMSO，北京化學試劑廠產品，3-NP購自于美國 Sigma 公司(純度為 98%)，鹽酸司來吉蘭片購自于山東綠葉制藥有限公司，α-synuclein(≥90%)購自于美國 Sigma 公司。主要儀器有細胞培養箱，日本三洋公司產品；超凈臺，蘇州凈化儀器廠生產；倒置顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司產品，流式細胞儀，美國BD公司產品。NIS-ELEMT BR圖像分析軟件，日本尼康。

1.2 細胞培養與藥物處理

1.2.1細胞培養 小鼠BV2細胞培養于含 10%小牛血清的MEM培養基中,置于 37℃,5%CO2孵箱中培養,其中加入 100 U/mL青霉素,100 mg/L鏈霉素。培養 24 h后換液。細胞傳代時,先吸去瓶中的培養基,加入適量的 0.25%胰蛋白酶消化后輕輕吹打,以吹散細胞團,取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2藥物處理 200 μmol/L α-synuclein 溶液的配制，準確稱取 0.5 mg α-synuclein 溶于 173 μl緩沖液中。觀察細胞的變化。將對數生長期的細胞按所需濃度接種，4 h后細胞完全貼壁，分別設為空白對照組，α-Syn組，α-Syn+司來吉蘭組，每組培養24 h，收集各組細胞進行以下相應實驗，每個濃度均作8 個復孔,混勻培養。每個實驗重復3次。

1.3 細胞培養四氮唑藍實驗法(MTT 法)

取對數生長期的BV2細胞.分別以 1×104的濃度接種于 96 孔板,每孔 200 μl,置于 37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中孵育；按上述分組用藥物處理,在給藥后分別培養 24 h；達到預期培養時間前 4 h 終止培養,每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl,37℃孵育4 h,去除上清液。 每孔加入 200 μl DMSO,充分吹打震蕩,待藍色顆粒完全溶解后用酶標儀檢測 492 nm 的光密度值,計算存活率(存活率 =毒物作用組光密度值/正常對照組光 密度值 ×100%)。

1.4 采用TUNEl法檢測細胞凋亡

采用6孔板制作細胞爬片，4%多聚甲醛在常溫下固定30 min,PBS洗2 min×2次，蒸餾水洗滌2 min×2次，試驗操作按武漢博世德生物技術有限公司試劑說明書進行。TUNEL染色中細胞凋亡陽性物質呈棕黃色位于細胞核內，部分細胞漿也可因核DNA碎片的逸出呈陽性著色；陰性細胞呈藍色。每張涂片在400X高倍鏡下觀察5個視野，每個視野下分別計數凋亡細胞和總細胞數并計算凋亡指數(Apoptosis Index,AI)，求其平均值。AI(%)=凋亡細胞數/總細胞數×100%。每個指標做3次，每次TUNEL染色中以不含TdT的TdT buffer代替TUNEL反應混合液作陰性對照。

1.5 免疫細胞化學染色檢測 bcl-2、 bax、caspase-3、Caspase-9蛋白表達

采用6孔板制作細胞爬片，4%多聚甲醛固定后，空氣中晾干，采用免疫組化染色觀察相應蛋白表達。bcl-2、bax在胞質中呈棕黃色陽性表達；Caspase-3和 Caspase-9主要在胞質中表達。以細胞未著色或輕微著色為陰性。每一指標觀察3張細胞爬片，每張片在400X高倍鏡下觀察5個視野，每個視野下分別采用NIS-ELEMT BR分析陽性物質表達的平均光密度值。免疫細胞化學染色中以已知陽性物質的組織切片為陽性對照，各組均以PBS代替一抗作陰性對照。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 MTT法測定α-Syn及司來吉蘭處理后BV2細胞增殖的影響

表1結果顯示，α-Syn終濃度20 mM可以抑制BV2細胞生長，司來吉蘭100 μM可以明顯有效保護BV2細胞的生存(P<0.01)。

表1 司來吉蘭對抗α-Syn毒性的保護作用24hMTT結果

注：與α-Syn同濃度細胞生長抑制率比較，※※P<0.01。

2.2 TUNEL法檢測細胞凋亡

表2結果顯示，α-Syn終濃度20 mM可以導致BV2細胞凋亡，司來吉蘭100 μM可以明顯有效保護BV2細胞(P<0.01)。(見圖1-圖3)

圖1 對照組tunel(×400) 圖2 α-Syn組tunel(×400) 圖3 司來吉蘭+α-Syn tunel(×400)

表2 司來吉蘭對抗α-Syn細胞凋亡作用

注：與α-Syn同濃度細胞生長抑制率比較，※※P<0.01。

2.3 免疫細胞化學染色法檢測

表3結果顯示，各組凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax 、Caspase-9與Caspase-3均有表達，并且表達具有一致性，從視野內的細胞著色的深淺可以看出表達程度的增多和表達量的增加；統計分析可知：司來吉蘭100 μM可以明顯有效減少BV2細胞相關蛋白的表達量(P<0.01)。(見圖4-圖15)

表3 各組凋亡相關蛋白表達平均光密度值

注：與α-Syn同濃度數值比較，※※P<0.01。

圖4 對照組Bcl-2(×400) 圖5 α-Syn組Bcl-2(×400) 圖6 α-Syn+司來吉蘭Bcl-2(×400)

圖7 對照組Bax(×400) 圖8 α-Syn組Bax(×400) 圖9 司來吉蘭+α-Syn Bax(×400)

圖10 對照組caspase-3(×400) 圖11 α-Syn組caspase-3(×400) 圖12司來吉蘭+α-Syn caspase-3

(×400)

圖13 對照組caspase-9(×400) 圖14 α-Syn組caspase-9(×400) 圖15司來吉蘭+α-Syn caspase-9

(×400)

3 討論

α-突觸核蛋白的生理作用尚不明確。據報道它可以參與調節細胞的生長和分化、突觸可塑性和遞質的釋放以及參與某些信號傳導通路的調節[4]。Seo等研究發現低濃度的α-突觸核蛋白具有神經保護作用；高濃度的α-突觸核蛋白則表現為神經毒性作用[5]。但是，α-Syn 在病理情況下的異常高表達是否影響神經膠質細胞的凋亡尚未明確。 本研究以BV2 細胞為模型，體外研究高水平的 α-突觸核蛋白對細胞凋亡的作用。

在細胞凋亡的過程中， Bcl-2家族蛋白是細胞凋亡的關鍵調節分子[6]。根據其結構和功能分為抗凋亡基因及促凋亡基因，促凋亡蛋白包括Bax、Bak、Bok、Bad、Bid、Bim、Bmf、Bik、Hrk、Noxa、Puma等，抗凋亡蛋白包括Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w、Mcl-1、Bcl-B等，正常情況下抗凋亡蛋白發揮作用可抑制凋亡的發生，當細胞受到損傷或脅迫時，抗凋亡蛋白功能受到抑制，而促凋亡蛋白發揮作用，從而引起細胞凋亡[7]。本結果表明，α-Syn 高表達導致bcl-2基因表達明顯降低，而Bax基因表達明顯升高，α-Syn組凋亡指數較對照組明顯增加，表明bcl-2/Bax參與α-Syn 高表達導致BV2 細胞凋亡，而司來吉蘭可以減少α-Syn 高表達誘導的BV2細胞凋亡。

誘導細胞凋亡必要的信號分子是一類半胱氨酸蛋白酶稱為Caspases家族。該家族共有十幾個成員，可以彼此之間互相活化形成級聯反應[8]。Caspases在凋亡程序的啟動和執行過程中起著重要作用，直接參與凋亡的早期啟動、凋亡信號傳遞及凋亡晚期事件，導致細胞皺縮、膜出泡及DNA斷裂等凋亡特征現象[9]。即Caspases分為啟動型和執行型，前者接受死亡信號、啟動凋亡或激活下游的分子，包括Caspases-2、Caspases-8、Caspases-9、 Caspases-10等；后者則降解細胞骨架、蛋白質、核酸等，包括Caspases-3、 Caspases-6、Caspases-7等[10]。本研究結果表明，α-Syn 高表達導致Caspases-9、Caspases-3表達明顯升高，說明α-Syn誘導BV2細胞凋亡是通過線粒體細胞色素C介導的凋亡通路，啟動Caspase級聯反應，導致細胞凋亡。 而司來吉蘭可以降低α-Syn 高表達導致的Caspases-9、Caspases-3表達升高，減少細胞凋亡。

本研究探討了α-Syn 高表達對BV2 細胞凋亡的作用，為揭示 PD 及 DLB 等與 α-Syn 相關的神經退行性疾病的機制提供了線索。