植物甾醇酯對非酒精性脂肪肝大鼠肝臟部分代謝物的影響

歐陽鵬凌，管 玘，曲 丹，丁信文，宋立華,3,*

（1.上海交通大學農業與生物學院，上海 200240；2.上海市第七人民醫院營養科，上海 200137；3.上海交通大學陸伯勛食品安全研究中心，上海 200240）

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver，NAFLD）是代謝綜合征在肝臟中的表現[1]。隨著肥胖及其相關代謝綜合征的全球化流行趨勢，NAFLD現已成為歐美等發達國家和我國富裕地區慢性肝病的重要病因。流行病學調查結果顯示，在世界范圍內NAFLD的患病率為6%～33%，在我國其發病率約為15%[2]。NAFLD發生初期，通過調整飲食和加強運動，肝臟的脂肪變性會逆轉，但若任其發展，其中有10%～20%會逐漸發展為非酒精性脂肪性肝炎，其10 年內肝硬化發生率高達25%[3]；此外，NAFLD還與2型糖尿病、心血管疾病的發生密切相關，因此，NAFLD已成為21世紀世界范圍內的一個重要的公共健康問題。

肝臟是人體最大的代謝器官，參與糖、脂類、蛋白質等的代謝過程，在物質代謝過程中發揮樞紐作用[4]。當肝臟出現脂肪病變時，必然會導致相關代謝通路發生變化[5]。由于各物質代謝通路的復雜性，只有利用代謝組學方法分析才能反映病理狀態下機體代謝產物的整體性變化[6]。蔣華軍[7]研究發現與正常對照相比，NAFLD大鼠肝臟組織代謝物中脂類、氨基酸類以及糖類的含量均出現明顯變化；另有研究對NAFLD患者血液進行代謝組學檢測，發現糖類、脂類、氨基酸類及胺類化合物等11 種差異代謝物[8]。黃海軍[5]對肝病患者糞便做代謝組學檢測，結果顯示膽汁酸類、膽素原類以及膽堿類等與正常組相比有明顯變化。這些差異代謝物的檢出為NAFLD的預防、診治及其相關機制的研究提供了新思路。

植物甾醇（phytosterols，PS）是一類存在于食物中的天然化合物[9]，其酯化產物即植物甾醇酯（phytosterol esters，PSE）具有較好的溶解特性。前期研究發現PSE可顯著減輕NAFLD大鼠肝臟的脂肪變性程度[10]。為進一步研究PSE干預后如何影響肝臟代謝物的變化，本實驗擬在前期研究基礎上，利用高脂飲食誘導建立NAFLD大鼠模型，同時通過灌胃不同劑量PSE連續干預12 周后，檢測肝臟總脂肪含量，利用超高效液相色譜-四極桿串聯飛行時間質譜（ultraperformance liquid chromatography tandem time-of-fight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）技術檢測PSE對NAFLD大鼠肝臟小分子代謝物的影響，從代謝組學的角度進一步闡明PSE有效預防NAFLD的機制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

6 周齡雄性清潔級SD大鼠，體質量（170±10）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司（生產許可證號：SCXK（滬）2012-0002）。大鼠飼料由福貝世亨生物醫藥（上海）有限公司提供，基礎飼料組成：粗蛋白≥20%（質量分數，下同）、水分≤10%、灰分≤8%、粗纖維≤5%、粗脂肪≥4%、鈣1%～1.8%、賴氨酸1.32%、磷0.6%～1.2%、蛋氨酸＋胱氨酸0.78%；高脂飼料組成：繁殖鼠飼料52.65%、豬油21%、蔗糖10%、酪蛋白10%、麥芽糊精2.7%、預混料1.9%、膽固醇1.25%、膽鹽0.5%。

植物甾醇酯（植物甾醇和植物甾醇酯≥97%，其中游離植物甾醇≤6%、總植物甾醇≥59%、植物甾醇酯≥91%；甾醇的組成：β-谷甾醇42.0%～55.0%、菜油甾醇20.0%～29.0%、豆甾醇12.0%～23.0%、菜籽甾醇≤6%、D5-燕麥甾醇≤4%、膽甾醇≤2%、D7-燕麥甾醇≤2%、D7-豆甾烯醇≤2%、其他≤5%）由巴斯夫中國有限公司提供。

分析純氯仿、甲醇均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Acquity UPLC I-Class系統（由二元泵、真空脫氣機、自動進樣器和柱溫箱組成）、VION IMS Q-TOF-MS儀美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 灌胃用PSE強化牛奶的制備

將PSE產品于65 ℃水浴中液化，與純牛奶混合并通過高壓均質乳化，得到PSE質量濃度分別為0.05、0.10 g/mL的PSE強化牛奶。

1.3.2 實驗動物分組與樣本收集

大鼠適應性喂養1 周后隨機分為4 組：正常對照組（NC，n=4）、高脂模型組（HF，n=9）、低劑量PSE組（PSE-L，n=9）和高劑量PSE組（PSE-H，n=9）。NC組大鼠進食基礎飼料，其余各組進食高脂飼料。NC和HF組灌胃給予等體積普通脫脂牛奶，低（0.05 g/（100 g·d mb））、高劑量（0.1 g/（100 g·d mb））PSE干預組分別灌胃給予上述PSE強化牛奶（相當于成人3 g/d和6 g/d的攝入量），連續灌胃12 周。飼養環境條件：室溫為（25±1）℃，相對濕度為45%～65%，12 h明暗輪換采光，大鼠可自由進食及飲水。期間每天記錄各組大鼠攝食量，每周稱量記錄其體質量。實驗結束后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉，按劑量40 mg/kg麻醉大鼠后取出大鼠肝臟，用生理鹽水漂洗干凈，分裝并迅速于液氮中冷凍，然后轉移至－80 ℃低溫冰箱中貯存備用，本實驗檢測選取肝右葉同一部位。

1.3.3 肝臟總脂肪含量測定

稱取1 g肝臟組織樣品，加入8 mL氯仿-甲醇溶液（體積比2∶1，下同）研磨至勻漿狀，移入15 mL離心管，殘留物用2 mL氯仿-甲醇溶液均沖洗至離心管，超聲處理（400 W，20 min）后2 000 r/min離心5 min，取上清液，加入2.5 mL KCl溶液，靜置1 h分層，2 000 r/min離心5 min后吸去上層液，取下層液于70 ℃水浴鍋蒸干后，烘箱烘干至恒質量，稱質量即可得到1 g肝臟中脂肪的總質量[6]。

1.3.4 肝組織樣品前處理

取50 mg大鼠肝臟組織于研磨管中，分別加入250、500、750 μL的溶劑（乙腈、甲醇、水體積比為2∶2∶1）后勻漿（60 Hz、20 s），靜置1 h（每15 min漩渦混合一次）后離心（12 000 r/min、10 min、4℃），吸取上清液，進樣檢測。

1.3.5 UPLC -Q-TOF-MS分析方法

1.3.5.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫：45 ℃，進樣量：1 μL。流動相A為體積分數0.1%甲酸的水溶液，流動相B為體積分數0.1%甲酸的乙腈溶液。洗脫程序：0～1 min，95%～80% A；1～2.5 min，80%～60% A；2.5～9min，60%～0%A；9～12 min，0% A；12～12.5 min，0%～95% A；12.5～14.5 min，95% A；流速0.4 mL/min。

1.3.5.2 質譜條件

離子源以正和負電噴霧電離模式運行。全信息串聯質譜掃描模式：在運行期間使用低能量（碰撞能量4 eV）和高能量（碰撞能量20～45 eV）兩種全信息串聯質譜模式交替采集，氬氣（純度99.999%）作為碰撞誘導解離氣體，氮氣（純度＞99.5%）作為去溶劑化和錐形氣體。掃描范圍50～1 000 amu；掃描速率：一次掃描用0.2 s；毛細管電壓2 kV（正離子模式）、1 kV（負離子模式）；錐形電壓40 V；源偏置60 V；源溫度115 ℃；去溶劑化氣體溫度450 ℃；去溶劑化氣體流量900 L/h；錐形氣體流量50 L/h。鎖定質量校正：乙腈-水-甲酸（體積比50∶49.9∶0.1）中的250 ng/mL亮氨酸腦啡肽標準校正溶液通過參比探針連續輸注（5 μL/min），每30 s掃描一次。

1.4 數據統計分析

肝組織脂肪含量采用單因素方差分析進行組間比較，P＜0.05為差異有統計學意義（SPSS 20.0軟件）。UNIFI 1.8.1軟件用于肝臟代謝組學數據采集，原始數據導入Progenesis QI v2.3進行峰采集、比對和歸一化，以得到保留時間和質荷比（m/z）數據的峰強度等。將篩選編輯后的結果組織為二維數據矩陣，在SIMCA-P軟件中進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA），根據模型得到的變量權重值（VIP＞1）、Student-t檢驗的P值（P＜0.05）以及最小變異系數（CV＜30%）等來尋找差異性表達代謝物?；诰_質量以及高能質譜中的碎片，在HMDB和L v2.3ipid數據庫中進一步鑒定化合物。運用EZinfor v3.0.3軟件對產生的歸一化峰強度做進一步的統計分析。通過在線數據庫HMDB（http://www.hmdb.ca/）、lipidmaps（http://www.lipidmaps.org/tools/）、LipidBank（http://www.lipidbank.jp/）、KEGG（http://www.kegg.jp/）、Metabo Analyst（http://www.metaboanalyst.ca/faces/upload/PathUploadView.xhtml）等檢索差異性代謝物及其所參與的代謝通路。采用GraphPad Prism 6軟件作圖，結果以平均值±標準差表示。數據采用SPSS Statistics 20軟件進行單因素方差顯著性分析，并用Tukey HSD法兩兩比較，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 PSE干預對NAFLD大鼠攝食量的影響

表1 PSE干預對NAFLD大鼠攝食量的影響Table 1 Effect of PSE on daily diet consumption of NAFLD rats

由表1可知，1～9 周內，隨著大鼠周齡的增加，各組大鼠的攝食量均有所增加，其中實驗至第9周后，NC組及PSE-H組大鼠攝食量較接近，與之前相比無明顯變化，而HF組及PSE-L組攝食量較之前略有下降。這可能是由于高脂飼料熱量較高，引起大鼠食欲下降，而高劑量PSE可更好地調節脂代謝，因此使大鼠保持正常食量。事實上后期代謝檢測結果也發現，PSE-H組大鼠的代謝情況與NC組更接近，提示高劑量PSE（相當于人每天攝入6 g）可能會更好地發揮調節脂代謝作用。

2.2 PSE干預對NAFLD大鼠體質量的影響

表2 PSE干預對NAFLD大鼠體質量的影響Table 2 Effect of PSE on body mass of NAFLD rats

表2中數據為起始至實驗結束各組大鼠體質量的變化情況。實驗初始時間各組大鼠體質量無顯著差異；從第6周開始至實驗結束HF組大鼠體質量一直高于其他組，到第12周時HF組大鼠體質量最高，PSE-L組次之。表明高脂飲食會導致體質量增加，有肥胖的趨勢，而本實驗中高劑量PSE干預可減緩體質量的增長。

2.3 PSE干預對肝組織總脂肪含量的影響

圖1 PSE對NAFLD大鼠肝臟總脂肪含量的影響Fig. 1 Effect of PSE on total fat content in liver of NAFLD rats

由圖1可知，HF組較NC組肝臟脂肪含量極顯著升高（P＜0.01），而PSE-L和PSE-H干預組大鼠肝臟中總脂肪含量均較HF組極顯著下降（P＜0.01），PSE-L和PSE-H兩組肝組織脂肪含量接近。

2.4 肝組織代謝物檢測不同前處理方法比較

實驗分別采用250、500、750 μL的溶劑（乙腈-甲醇-水體積比2∶2∶1）處理樣品后，從圖2a～f可以看出：在正、負離子模式下，500、750 μL溶劑量較250 μL溶劑量在8～10 min內，出峰數目更多，且峰形更好，而負離子模式的圖2f可以看出，750 μL溶劑量下其響應較低。為了增強代謝物的提取效果，最終選擇在50 mg肝臟組織中加入500 μL的溶劑（乙腈、甲醇、水體積比2∶2∶1）作為提取條件。

圖2 3 種不同前處理方法在UPLC-Q-TOF-MS正、負離子模式下的基峰離子流圖譜比較Fig. 2 Comparison of base peak ion current patterns in positive and negative modes of UPLC-Q-TOF-MS under different pretreatment conditions

2.5 PSE干預對肝組織部分小分子代謝物的影響

2.5.1 多維統計分析

圖3 各組肝組織小分子代謝物PCA和PLS-DA分析圖Fig. 3 PCA and PLS-DA scores of small-molecule metabolites in livers of different groups

對各組大鼠肝組織小分子代謝物進行PCA分析，一般來說當模型概括X矩陣解釋率（R2X）＞0.4時表明該模型可靠，R2Y越接近于1說明模型的穩定性越好。本實驗樣品在正離子模式下R2X=0.74，負離子模式下R2X=0.68，因此本實驗所建立的模型可用于各組之間代謝譜差異的可視化觀察。為了更好地區分組間差異，提高模型的有效性，過濾與模型分類不相關的正交信號，采用PLS-DA方法對樣品進行進一步分析，得到在正離子模式下R2Y=0.54，負離子模式下R2Y=0.77。由圖3中PLS-DA圖可知，HF組與PSE-L組分布差異較小，而PSE-H組與HF組區分明顯。

2.5.2 差異代謝物的確認

圖4 正離子模式下磷脂酰膽堿（18∶1（6Z）/0∶0）的低（a）、高（b）能量譜圖Fig. 4 Low-(a) and high-(b) energy spectra of PC (18:1(6Z)/0:0) in positive ion mode

TOF-MS可以在低碰撞能掃描和高碰撞能掃描之間快速切換，從而同時完成兩個掃描功能的數據采集。低能量掃描可以得到分子離子峰以及加合峰的信息，結合Mass FragmentTM確定化合物的可能分子式。通過高能量掃描產生的碎片離子信息，了解化合物可能的結構片段，再利用保留時間將低、高能量得到的信息進行關聯，并與輸入電腦中的MOL文件進行比對，從而對物質進行初步的定性。以磷脂酰膽堿（18∶1（6Z）/0∶0）為例，根據圖4中低能量圖譜可以看到，準分子離子峰為m/z522.3545[M+H]+，磷脂酰膽堿（18∶1（6Z）/0∶0）的精確相對分子質量為521.348 14。該物質的高能量質譜圖中部分碎片離子如圖5所示，通過比對UNIFI軟件中給出的磷脂酰膽堿（18∶1（6Z）/0∶0）結構并結合其裂解規律，推斷出該物質是磷脂酰膽堿（18∶1（6Z）/0∶0）。按照此方式，采集分析正負離子模式下得到的差異代謝物后，篩選出20 種差異代謝物如表3所示，其中19 種為脂類，1 種差異代謝物為膽汁酸類。用HMDB（http://www.hmdb.ca/）、lipidmaps（http://www.lipidmaps.org/tools/）、Pubchem（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound）、KEGG（http://www.kegg.jp/）等數據庫以及文獻對差異代謝物進行搜索，了解其作用和所參與的代謝通路。

表3 PSE干預對NAFLD大鼠肝組織中差異代謝物的影響Table 3 Effect of PSE intervention on differential metabolites in liver of NAFLD rats

圖5 磷脂酰膽堿（18∶1（6Z）/0∶0）高能量譜圖中部分碎片離子Fig. 5 Selected fragment ions off PC(18:1(6Z)/0:0) in high-energy spectra

表3為20 種變量權重值（VIP）大于1的差異代謝物的質荷比、保留時間及其在Lipidmaps中的編號。從表3中數據可以看出，與HF組同一代謝物響應值相比較，NC組中代謝物離子強度水平低于或者高于HF組時，PSE-H組中也表現出相同的趨勢，進一步提示高脂飲食條件下，高劑量PSE干預可有效減輕脂代謝紊亂，大鼠代謝狀況與正常對照組更接近。

圖6為20 種差異代謝物在各組大鼠肝臟中離子強度的比較。HF組與NC組比較，20 種差異代謝物均有極顯著性差異（P＜0.01）。總體來看，PSE-H組差異代謝物強度變化趨勢與NC組更接近，其中PSE-H組中的磷脂酰乙醇胺（20∶3（8Z，11Z，14Z）/22∶6（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z）、22∶6（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z）/17∶1（9Z））、磷脂酰甘油（17∶2（9Z，12Z）/22∶6（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z））、磷脂酸（20∶1（11Z）/0∶0）、磷脂酰膽堿（16∶0/16∶1（9Z））離子強度較HF組顯著下降（P＜0.05）；磷脂酸（16∶0/20∶2（11Z，14Z））、磷脂酰膽堿（16∶0/18∶1（11E）、18∶1（6Z）/0∶0）、18∶1（9Z）/18∶0、20∶3（8Z，11Z，14Z）/0∶0）、鞘磷脂（d18∶0/16∶0）、甘氨膽酸、溶血卵磷脂（18∶1（9Z）、20∶3（5Z，8Z，11Z）、20∶3（8Z，11Z，14Z））、磷脂酰膽堿（15∶0/18∶1（11Z）、16∶0/2∶0）、17∶1（10Z）/0∶0）、19∶3（10Z，13Z，16Z）/0∶0）的離子強度較HF組極顯著降低（P＜0.01）；而磷脂酰膽堿（20∶4（5Z，8Z，11Z，14Z）/14∶0）則有明顯上升（P＜0.05）。

圖6 各組大鼠肝組織中主要的差異代謝物離子強度比較Fig. 6 Comparison of ionic strengths of major differential metabolites in rat liver from each group

2.5.3 代謝通路分析

圖7 通過Metabo Analyst得到的通路分析概要圖Fig. 7 Pathway analysis profile obtained by Metabo Analyst

將表3中的差異代謝物輸入Metabo Analyst（ http://www.metaboanalyst.ca/faces/upload/PathUploadView.xhtml）數據庫中，進行代謝通路濃縮與拓撲分析，對可能的生物擾動途徑進行分析評估，選擇代謝通路影響值大于0.10的作為潛在的靶向途徑，構建代謝通路如圖7所示。由圖8和表4可以看到，通過篩選影響值，得到由溶血卵磷脂以及磷脂酰膽堿參與的甘油磷脂代謝通路，該通路的影響值為0.183 33。圖8紅色部分為本實驗檢測出在甘油磷脂代謝通路中的差異代謝物：磷脂酰膽堿（15∶0/18∶1（11Z），16∶0/16∶1（9Z）），以及溶血卵磷脂（18∶1（9Z），20∶3（5Z，8Z，11Z），20∶3（8Z，11Z，14Z）。表4為這5 種VIP＞1的差異代謝物在HMDB、PubChem以及KEGG數據庫中的編號。由代謝通路分析提示PSE可通過對糾正高脂飲食誘導的甘油磷脂代謝紊亂，發揮其對NAFLD的預防作用。

圖8 通過Metabo Analyst得到的甘油磷脂代謝通路Fig. 8 Glycerophospholipid metabolism pathway obtained by Metabo Analyst

表4 參與甘油磷脂代謝通路的差異代謝物Table 4 Differential metabolites involved in glycerophospholipid metabolism

3 討 論

van Ginneken等[12]研究了NAFLD小鼠饑餓導致的肝臟代謝組學變化，利用氯仿、甲醇、水提取肝臟組織樣品，LC-MS檢測結果發現甘油三酯、溶血卵磷脂以及磷脂酰膽堿在NAFLD小鼠肝臟中含量明顯增加。另有相似研究運用氯仿、甲醇、水對肝臟組織進行前處理，研究NAFLD發生發展過程中肝臟代謝物的變化，與正常組相較有顯著差異的物質為溶血卵磷脂、甘油磷酸乙醇胺以及游離脂肪酸（主要是花生四烯酸）[13]。在對NAFLD大鼠肝臟代謝組學研究中，Hall等[14]運用氯仿、甲醇、丙二醇以及水混合提取劑，LC-MS法檢測出磷脂酰膽堿、甘油三酯以及高級脂肪酸等差異代謝物。另有研究利用甲醇水溶液勻漿處理肝臟組織后，通過LC-MS研究NAFLD的肝臟代謝組學，結果發現差異代謝物主要為磷脂酰膽堿、磷酸乙醇胺、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、二酰基甘油、甘油三酯[15]。此外，Qi Suwen等[16]用甲醇對肝臟組織進行研磨，進一步通過LC-MS研究NAFLD的肝臟小分子代謝物變化，得到的差異代謝物有硬脂酸、棕櫚酸等高級脂肪酸，以及L-色氨酸、L-蛋氨基酸、谷氨酸以及L-谷氨酰胺等氨基酸，考慮到前期已對PSE干預后NAFLD大鼠肝組織脂肪酸代謝譜進行了研究（數據未發表），且由于NAFLD的發病機制主要與脂代謝紊亂相關，因此本研究以乙腈-甲醇-水（體積比2∶2∶1）為提取劑進行差異代謝物的提取和篩選。實驗篩選出20 種差異代謝物主要為磷脂類（溶血卵磷脂、磷脂酰膽堿、鞘磷脂、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油）以及膽汁酸類（甘氨膽酸），其中溶血卵磷脂和磷脂酰膽堿參與了甘油磷脂代謝通路。

溶血卵磷脂是低密度脂蛋白的主要成分，可以誘導細胞膜脂質過氧化，進一步導致炎癥的出現，在細胞膜與介導信號轉導過程中發揮重要作用[17]。近年來大量研究表明溶血卵磷脂在多種肝臟疾病和肝毒性的發生發展過程中有明顯的變化。一般而言，溶血卵磷脂在細胞或組織中的量很少，如果濃度過高則會對細胞的膜系統造成傷害[18]。有研究顯示在肝細胞中磷脂酶活性物質的積累可以導致溶血卵磷脂的生成，致使肝細胞損傷甚至死亡，而細胞死亡會激活炎癥通道，促進炎癥細胞的增多，最終引起脂質代謝紊亂[19]。另有研究顯示，肝損傷會導致磷脂酰膽堿的合成增加，從而代償性地對肝組織起到一定的保護作用[20]。本實驗發現高脂飲食可誘導肝組織中溶血卵磷脂和磷脂酰膽堿含量上升，而高劑量PSE干預后溶血卵磷脂和磷脂酰膽堿的含量顯著降低，有向正常水平調節的趨勢，表明PSE通過調節甘油磷脂代謝通路減輕NAFLD的發生及發展。

此外，本實驗結果顯示，HF組中鞘磷脂的離子強度較對照組顯著上升，高劑量PSE干預后，鞘磷脂含量較HF組顯著下降。已有文獻指出在炎癥、代謝紊亂等病變過程中鞘磷脂的含量有所上升[21]，大量研究提示，神經酰胺參與了NAFLD的發生發展過程[22]，而鞘磷脂可以通過鞘磷脂酶水解生成神經酰胺[23]。神經酰胺能促進胰島素抵抗，增加運送到肝臟內的游離脂肪酸含量，引起脂質蓄積，進一步導致肝臟脂質代謝紊亂[24]。其次，神經酰胺刺激機體，使得體內活性氧增多，加劇脂質過氧化，最終使肝細胞出現炎癥、壞死甚至肝纖維化[25]。

磷脂酸可以通過Akt-mTOR信號通路刺激巨噬細胞，引發炎癥因子：腫瘤壞死因子、白介素-1β和白介素-6分泌增多[26]。本實驗中，HF組的磷脂酸離子強度較正常對照組顯著增加，表明高脂飲食會激發機體內的炎癥反應，而高劑量PSE組較單純高脂飲食組可顯著降低肝組織中磷脂酸的含量。磷脂酰乙醇胺N-甲基轉移酶（phosphatidylethanolamine N-methyltransferase，PEMT）可以催化磷脂酰乙醇胺。當PEMT的活性被抑制時，磷脂酰乙醇胺的含量會增加，誘導內質網出現應激反應，小脂滴發生融合現象，形成較大的脂滴聚積，最終打破脂質代謝的平衡[27]；另一方面，磷脂酰乙醇胺的上調可能會導致細胞通透性加強，促進巨噬細胞和中性粒細胞的浸潤，造成肝損傷程度更加嚴重[28]。本研究中高劑量PSE組肝組織中磷脂酰乙醇胺離子強度較模型組明顯降低，提示PSE可通過降低磷脂酰乙醇胺含量，調節脂代謝平衡，減少肝臟中的脂滴積聚，減輕炎癥反應。

磷脂酰甘油是細胞膜的主要組成成分[29]，對細胞膜的通透性和生理功能有直接影響。炎癥的發生、發展以及消退過程均有磷脂酰甘油的參與，其含量變化可以很好的反映機體內脂類代謝是否紊亂，所以磷脂酰甘油含量是一個重要的生物學指標[30]。實驗結果中高劑量PSE干預后肝組織中的磷脂酰甘油含量較HF組顯著下降，進一步說明高劑量的PSE在一定程度上減輕高脂飲食導致的脂質代謝紊亂及炎癥反應。

動物膽汁中主要是結合型膽汁酸，其中就包括甘氨膽酸。肝臟是膽固醇分解的主要代謝場所，可通過7α-羥化酶將膽固醇轉化生成膽汁酸[31]。PSE在體內可以被水解為植物甾醇，植物甾醇與膽固醇的結構相似，可以競爭性地附著于腸上皮受體，限制膽固醇的吸收，最終降低膽固醇水平[32]。由實驗結果可以看出HF組肝臟中膽汁酸含量較正常對照組顯著升高，這可能是由于高脂飲食造成肝組織中膽固醇較高，PSE干預可降低NAFLD大鼠肝臟中的膽固醇含量降低[11]，進一步導致轉化生成的膽汁酸含量下降，提示PSE通過降低膽固醇水平調節膽汁酸合成與分泌。

4 結 論

本實驗運用UPLC-Q-TOF-MS技術研究PSE干預對NAFLD大鼠肝組織小分子代謝物的影響，篩選出20 種差異代謝物，分別為參與甘油磷脂代謝通路的磷脂類和膽汁酸類，研究結果發現PSE干預后可降低肝組織中溶血卵磷脂、磷脂酰膽堿、鞘磷脂、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油的含量，提示其可通過甘油磷脂代謝通路調節脂類代謝紊亂，減輕高脂飲食誘導的肝臟脂質積累，從而抑制NAFLD的發生發展。