淫羊藿苷脂質(zhì)體經(jīng)鼻給藥對(duì)帕金森病大鼠行為學(xué)及神經(jīng)遞質(zhì)的影響

程志清 黃建平 朱文宗 支英豪 趙應(yīng)征

[摘要] 目的 觀察經(jīng)鼻給予淫羊藿苷脂質(zhì)體對(duì)帕金森病模型大鼠的行為學(xué)癥狀及紋狀體相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響。 方法 按隨機(jī)原則選16只大鼠為假手術(shù)組（假手術(shù)/in組），另將64只造模成功的PD大鼠分為PD模型組（PD/in組）、淫羊藿苷脂質(zhì)體經(jīng)鼻給藥組（ICA-PGL/in組）、淫羊藿苷經(jīng)鼻給藥組（ICA/in組）、淫羊藿苷脂質(zhì)體靜脈注射給藥組（ICA-PGL/iv組），每組16只。藥物持續(xù)干預(yù)2周后，通過(guò)檢測(cè)大鼠阿撲嗎啡旋轉(zhuǎn)次數(shù)、圓筒實(shí)驗(yàn)、紋狀體區(qū)TH表達(dá)以及相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)含量的改變來(lái)觀察淫羊藿苷脂質(zhì)體結(jié)合經(jīng)鼻給藥方式對(duì)帕金森病模型大鼠的療效。 結(jié)果 淫羊藿苷各治療組運(yùn)動(dòng)功能較PD/in組有不同程度的改善，紋狀體區(qū)雙側(cè)TH陽(yáng)性纖維表達(dá)及紋狀體區(qū)右側(cè)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA、DOPAC和HVA含量較PD/in組均有不同程度的提高，其中以ICA-PGL/in組療效最為突出（P<0.01）。 結(jié)論 經(jīng)鼻給藥淫羊藿苷脂質(zhì)體對(duì)帕金森病模型大鼠運(yùn)動(dòng)功能及神經(jīng)遞質(zhì)的修復(fù)有不錯(cuò)的療效。

[關(guān)鍵詞] 淫羊藿苷脂質(zhì)體;帕金森病模型;經(jīng)鼻給藥;行為學(xué);神經(jīng)遞質(zhì)

[中圖分類號(hào)] R285.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）19-0043-05

[Abstract] Objective To observe the effects of nasal administration of icariin liposome on behavioral symptoms and striatum-associated neurotransmitter levels in Parkinson's disease model rats. Methods Sixteen rats were randomly selected as sham operation group（sham operation/in group）， and 64 successful modeling PD rats were divided into PD model group（PD/in group） and icariin liposome intranasal administration group（ICA-PGL/in group）， icariin intranasal administration group（ICA/in group）， and icariin liposome intravenous administration group（ICA-PGL/iv group）， 16 rats in each group. After two weeks of continuous drug intervention， the efficacy of icariin liposome combined with nasal administration on Parkinson's disease model rats was observed by numbers of apomorphine rotation， cylinder test， TH expression in striatum and changes of related neurotransmitters. Results The results showed that the motor function of each icariin treatment group was improved to some extent when compared with the PD/in group. The expression of bilateral TH-positive fibers in the striatum and the levels of monoamine neurotransmitter DA， DOPAC and HVA on the right side of the striatum were increased in different degrees when compared with PD/in group， and the effect in ICA-PGL/in group was the most significant（P<0.01）. Conclusion The intranasal administration of icariin liposomes has a good effect on the motor function and neurotransmitter repair in Parkinson's disease model rats.

[Key words] Icariin liposome; Parkinson's disease model; Intranasal administration; Behavior; Neurotransmitter

帕金森病（Parkinsons disease，PD）是一種神經(jīng)退行性疾病，常發(fā)生于中老年人。PD在中醫(yī)學(xué)中雖然沒有相對(duì)應(yīng)、獨(dú)立的中醫(yī)病名，但根據(jù)各家中醫(yī)描述，屬于中醫(yī)學(xué)中的“顫證”范疇，同時(shí)全國(guó)中醫(yī)學(xué)會(huì)老年醫(yī)學(xué)會(huì)在1991年腦病學(xué)術(shù)研討會(huì)上制定的《中醫(yī)老年顫證診斷和療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》里將PD的中醫(yī)病名確定為“顫證”[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為本病的基本病機(jī)為腎精虧虛，髓海失充，最終導(dǎo)致筋脈失濡、肢體失控。“腎主骨生髓”，同時(shí)“腦為髓之海”，因此可以通過(guò)服用滋腎益筋藥物，達(dá)到補(bǔ)益腦髓及改善顫證的療效。滋腎藥物中的代表藥物淫羊藿的主要活性成分淫羊藿苷具有較好的補(bǔ)腎強(qiáng)筋、改善腦功能等作用[2]。穩(wěn)定的淫羊藿苷脂質(zhì)，結(jié)合經(jīng)鼻給藥方式，可以避免口服給藥方式產(chǎn)生的藥物首過(guò)效應(yīng)，同時(shí)繞過(guò)血腦屏障，彌補(bǔ)傳統(tǒng)給藥方式入腦有效量少的缺點(diǎn)，促使藥物以更高的生物利用度進(jìn)入腦組織，發(fā)揮藥效，而且前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)鼻黏膜有較好的安全性[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備淫羊藿苷脂質(zhì)體[3，4]結(jié)合經(jīng)鼻給藥方式觀察其對(duì)PD大鼠的療效。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物? 選用由上海斯萊克公司提供的SD清潔級(jí)雄性大鼠，體重約280～320 g，大鼠飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自然光照，自由進(jìn)食及飲水，室溫維持在25℃。許可證號(hào)：SCXK（滬）2003-0003。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物? 實(shí)驗(yàn)室已具備成熟制備脂質(zhì)體技術(shù)，制備并得到平均粒徑250 nm淫羊藿苷脂質(zhì)體[4]。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[4]，將各藥物組均配置成含淫羊藿苷0.30 mg/mL濃度的淫羊藿苷脂質(zhì)體溶液或淫羊藿苷溶液。

1.1.3 主要藥品與試劑? 淫羊藿苷（克洛瑪生物科技有限公司）;氫化蛋黃磷脂、吐溫80及膽固醇等脂質(zhì)體相關(guān)制備材料（溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院）;6-羥基多巴（6-OHDA）、酪氨酸羥化酶抗體（TH）、阿樸嗎啡（APO）、戊巴比妥鈉及HE試劑等（Sigma-Aldrich公司）。

1.1.4主要儀器? 大鼠腦立體定向儀SR-6N9（日本Narishige公司）、低溫離心機(jī)5415R（Germany公司）、自動(dòng)勻漿機(jī)HFJ-8（北京華爾博科技有限責(zé)任公司）、20 μL微量注射器（上海精密儀器公司提供）、高效液相色譜儀Agilent 1100（美國(guó)Agilent）、光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備? 將大鼠麻醉后（戊巴比妥鈉溶液50 mg/kg），固定于腦立體定位儀（SR-6N9）上，將頭頂前囟部皮膚備皮、消毒，在中線位置切開一1.5 cm的切口。6-OHDA注射位點(diǎn)參考《大鼠腦立體定向圖譜》[5]，兩注射位點(diǎn)的位置分別為：前囟前0.7 mm，中線右3 mm，硬膜下4.5 mm以及前囟后0.2 mm，中線右2.6 mm，硬膜下 6.0 mm[6]。以2 μg/（μL·min）速度在每定位點(diǎn)各注射5 μL的6-OHDA（2 μg/μL濃度溶于0.2%的抗壞血酸生理鹽水中），注射完畢留置7 min后，以1 mm/min速度緩慢將注射針退出，縫合皮膚。假手術(shù)組僅注射含0.2%抗壞血酸的等體積生理鹽水，其余步驟均同上。

1.2.2 檢驗(yàn)?zāi)Ｐ? 造模4周后，腹腔注射 APO（0.5 mg/kg），計(jì)數(shù)30 min內(nèi)各組大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)，如超過(guò)7次/min，則視PD大鼠模型造模成功。

1.2.3 分組及干預(yù)? 隨機(jī)取16只SD大鼠作為假手術(shù)/in組，另將64只造模成功大鼠隨機(jī)分為四組，每組16只：PD/in組、ICA-PGL/in組、ICA/in組，ICA-PGL/iv組。假手術(shù)/in組和PD/in組予0.9%的生理鹽水經(jīng)鼻給藥，后三組分別予淫羊藿苷脂質(zhì)體經(jīng)鼻、淫羊藿溶液經(jīng)鼻及淫羊藿苷脂質(zhì)體靜脈注射給藥干預(yù)（給藥組每組淫羊藿苷濃度均為0.30 mg/mL）。所有實(shí)驗(yàn)組均為100 μL等體積給藥。

1.2.4 給藥方法? 鼻腔給藥：戊巴比妥鈉溶液30 mg/kg腹腔注射大鼠致輕度麻醉，仰臥位固定，大鼠鼻腔氣道與平臺(tái)維持趨于水平位置。每次取5 μL溶液（定量移液管吸取）緩慢滴入大鼠一側(cè)鼻孔，2 min后對(duì)另一側(cè)鼻孔給藥（相同方法），每隔2 min交換鼻孔，緩慢給藥避免大鼠嗆咳，每次給藥時(shí)間為40 min[7，8]。尾靜脈給藥：以濃度75%乙醇輕擦大鼠尾靜脈處，緩慢靜脈推注淫羊藿苷脂質(zhì)體溶液，給藥完畢后常規(guī)無(wú)菌止血。

1.2.5 標(biāo)本采集? 各組大鼠隨機(jī)取8只相應(yīng)處理結(jié)束24 h后，常規(guī)處死，冰冷生理鹽水心臟灌流致全身僵硬，斷頭及剝離完整大腦，固定于多聚甲醛（4%濃度）24 h以上。清水沖洗腦組織，取黑質(zhì)區(qū)、紋狀體區(qū)各切3 mm，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片。剩余各組大鼠麻醉處死，迅速斷頭、剝離腦組織，在冰面上快速分離出紋狀體，保存于-80℃ 冰箱備用。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 APO誘導(dǎo)轉(zhuǎn)圈? 造模4周及給藥2周后，腹腔注射 APO（0.5 mg/kg），計(jì)數(shù)30 min內(nèi)各組大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)。

1.3.2 圓筒實(shí)驗(yàn)? 圓筒試驗(yàn)主要用于評(píng)估前肢活動(dòng)的協(xié)調(diào)功能。在PD大鼠造模前1周及治療2周后，各組隨機(jī)選8只大鼠，置于透明的有機(jī)玻璃圓筒（20×30 cm）中，將鏡子置于圓筒后以完全觀察大鼠;記錄前肢與筒壁的接觸次數(shù)3 min。計(jì)算左前肢接觸與筒壁的比率的公式取自Karhunen H等[9]及Wei Chen等[10]。左前肢碰壁比率=（a+c×0.5）/（a+b+d）。其中a：左前肢接觸筒壁的次數(shù)，b：一只前肢保持接觸筒壁，然后另一只前肢接觸筒壁次數(shù)及雙上肢同時(shí)接觸筒壁的次數(shù);c：雙上肢同時(shí)接觸筒壁的次數(shù);d：右前肢接觸筒壁的次數(shù)。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色法? 免疫組化染片前，常規(guī)烤箱烤片30 min，二甲苯脫蠟以及水化。免疫組化步驟，按相關(guān)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)操作。

1.3.4 紋狀體區(qū)相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)? a.高效液相電化學(xué)（HPLC-ECD）檢測(cè)：色譜柱采用C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為水相（每1升中含辛烷磺酸鈉0.16 g，乙二胺四乙酸鈉10 mg，二水磷酸鈉15.60 g，氯化鉀 3.75 g，pH值4.9）與甲醇的體積比為13：87，流速為1.0 mL/min，柱溫25℃，電化學(xué)檢測(cè)器工作電極為玻璃碳電極，參比電極為銀/氯化銀（Ag/AgCl）電極，工作電壓為0.55 V，進(jìn)樣量均為20 μL，電導(dǎo)率為1055，檢測(cè)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)（DA、DOPAC和HVA）。b.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別稱取單胺類神經(jīng)遞質(zhì)（DA、DOPAC和HVA）5 mg置于50 mL棕色容量瓶中，用0.1 mol/mL HClO4定容，配置成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液，再用0.1 mol/mL HClO4稀釋至5000 ng/mL、1000 ng/mL、500 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、1 ng/mL，進(jìn)行高效液相電化學(xué)（HPLC-ECD）檢測(cè)。最后分別以相應(yīng)神經(jīng)遞質(zhì)的濃度對(duì)峰面積值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。c.處理：每毫克組織加高氯酸（現(xiàn)配0.1 mol/mL HClO4）10 μL，勻漿，12000 r/min、4℃條件下離心10 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取慮液進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究以SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。兩組之間計(jì)量資料比較用t檢驗(yàn)，多組間樣本比較用one-way ANOVA方法，兩兩比較采用SNK方法，P<0.01為有顯著性差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)比較

給藥2周后，各組大鼠腹腔注射APO，假手術(shù)/in組未見APO誘發(fā)的轉(zhuǎn)圈行為，ICA-PGL/in組[（5.58±1.0）次/min，P<0.01]、ICA/in組[（6.21±1.19）次/min，P<0.01]、ICA-PGL/iv組[（6.50±1.34）次/min，P<0.05]較PD/in組[（7.79±0.72）次/min]均有不同程度減少，其中以ICA-PGL/in組改善效果最為顯著。

2.2 各組大鼠圓筒實(shí)驗(yàn)比較

造模前，各組大鼠的左前肢碰壁次數(shù)及左前肢碰壁比率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。給藥2周后，假手術(shù)/in組的左前肢碰壁次數(shù)較造模前稍有下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），左前肢碰壁比率未見明顯變化，其他各組PD模型大鼠的左前肢碰壁次數(shù)及比率均較造模前顯著下降。同時(shí)與PD/in組比較，淫羊藿苷各治療組的左前肢碰壁次數(shù)及比率有不同程度的改善，以ICA-PGL/in組效果最為顯著（P<0.01）。見表2。

2.3各實(shí)驗(yàn)組大鼠黑質(zhì)區(qū)HE染色比較

如封三圖5示，假手術(shù)/in組大鼠雙側(cè)黑質(zhì)區(qū)及各實(shí)驗(yàn)組健側(cè)（左側(cè)）黑質(zhì)區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，分布密集;PD/in組大鼠受損側(cè)可見神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，部分胞體變小。與PD/in組受損側(cè)比較，淫羊藿苷各治療組受損側(cè)黑質(zhì)區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量不同程度增多，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較清晰，但有少數(shù)神經(jīng)元變性。

2.4 各實(shí)驗(yàn)組紋狀體部位 TH 陽(yáng)性神經(jīng)纖維比較

如封三圖6示，假手術(shù)/in組大鼠紋狀體區(qū)未見多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞分布，但可見多巴胺能神經(jīng)元纖維密集分布。其余各組大鼠損毀側(cè)紋狀體TH 表達(dá)（P<0.01）和健側(cè)紋狀體TH 表達(dá)較假手術(shù)/in組均有不同程度降低。ICA-PGL /in組雙側(cè)（P<0.01）、ICA/in組受損側(cè)（P<0.01）、健側(cè)（P<0.05）TH表達(dá)較PD/in組對(duì)應(yīng)側(cè)提高最為明顯，ICA-PGL/iv組雙側(cè)亦有改善趨勢(shì)（P>0.05）。同時(shí)治療組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ICA-PGL/in組TH陽(yáng)性表達(dá)最高（P<0.01）。見表3。

2.5 各實(shí)驗(yàn)組大鼠右側(cè)紋狀體的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量

ICA-PGL/in組右側(cè)紋狀體中3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量較PD/in組有明顯的提高（P<0.01），優(yōu)于ICA/in組（P<0.01）和ICA-PGL/iv組（P>0.05）。結(jié)果表明柔性納米脂質(zhì)體技術(shù)結(jié)合經(jīng)鼻給藥方式可以增強(qiáng)淫羊藿苷對(duì)PD大鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響。見表4。

3 討論

傳統(tǒng)給藥方式治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，藥物需經(jīng)過(guò)肝臟首過(guò)效應(yīng)及胃腸道酶的降解作用和血腦屏障，最終到達(dá)顱內(nèi)的劑量極少。為達(dá)到有效治療量，需增加藥物劑量，勢(shì)必帶來(lái)更大的藥物副作用和不良反應(yīng)。而通過(guò)腦實(shí)質(zhì)內(nèi)或鞘內(nèi)等途徑給藥治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有侵入性傷害和感染風(fēng)險(xiǎn)[11]。目前鼻腔給藥是一種無(wú)創(chuàng)、非侵入式的新興方法，可以繞過(guò)血腦屏障并將藥物靶向治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[12-14]。鼻腔通過(guò)嗅神經(jīng)、三叉神經(jīng)分支、面神經(jīng)分支可與中樞神經(jīng)系統(tǒng)直接聯(lián)系，經(jīng)鼻給藥可繞過(guò)血腦屏障，直接通過(guò)鼻腔通路到達(dá)中樞神經(jīng)細(xì)胞，有效增加顱內(nèi)藥物濃度[15，16]。但單純鼻腔給藥也存在較大問(wèn)題，包括藥物很難長(zhǎng)時(shí)間滯留于鼻腔，同時(shí)容易被鼻纖毛等清除[17]，另外鼻黏膜對(duì)外來(lái)的物質(zhì)刺激十分敏感。因此本實(shí)驗(yàn)制備了脂質(zhì)體包載的淫羊藿苷，其中脂質(zhì)體中磷脂雙分子層，可以有效實(shí)現(xiàn)控緩釋放藥物，起到平穩(wěn)血藥濃度的作用，同時(shí)，保護(hù)藥物在吸收以及轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中不被酶分解，達(dá)到增加藥物療效的作用[18]。前期實(shí)驗(yàn)亦表明其對(duì)鼻黏膜無(wú)明顯的毒副作用，有較好的安全性。

鼻腔藥物的吸收與藥物分子的大小、親油、親水平衡及酶在鼻腔的降解等[19]有關(guān)。通常鼻腔給藥隨藥物分子量增高，鼻腔吸收量逐漸降低，而小于1 000 的化合物經(jīng)鼻腔給藥后，生物利用度較高。另外小分子藥物或粒徑300 nm以內(nèi)的粒子可以通過(guò)鼻腔嗅部的嗅黏膜吸收，透過(guò)篩板經(jīng)嗅球入腦[3，20]。而本研究中淫羊藿苷分子量676.65，其脂質(zhì)體平均粒徑達(dá)258 nm，保證了淫羊藿苷脂質(zhì)體經(jīng)鼻入腦的可行性。

前期實(shí)驗(yàn)已表明淫羊藿苷脂質(zhì)體經(jīng)鼻給藥可以有效入腦，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)空白脂質(zhì)體對(duì)PD大鼠無(wú)治療作用，故本研究將不再設(shè)置空白脂質(zhì)體組。

本研究圓筒實(shí)驗(yàn)中，生理鹽水干預(yù)2周后，假手術(shù)/in組的左前肢碰壁次數(shù)較造模前有所下降（P>0.05），但左前肢碰壁比率未見明顯變化，同時(shí)假手術(shù)/in組未見APO誘發(fā)的轉(zhuǎn)圈行為，考慮假手術(shù)/in組的左前肢的碰壁次數(shù)下降和大鼠適應(yīng)圓筒環(huán)境導(dǎo)致碰壁次數(shù)下降有關(guān)。免疫組化實(shí)驗(yàn)中，PD/in雙側(cè)紋狀體TH陽(yáng)性表達(dá)較假手術(shù)/in組均有降低，可見單側(cè)（右側(cè)）注射6-OHDA制備大鼠模型，對(duì)對(duì)側(cè)（左側(cè)）紋狀體區(qū)TH神經(jīng)纖維表達(dá)亦有影響。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示淫羊藿苷不同劑型、不同給藥方式均能改善大鼠的肢體協(xié)調(diào)功能及提高紋狀體區(qū)多巴胺能神經(jīng)元纖維表達(dá)，其中以淫羊藿苷脂質(zhì)體經(jīng)鼻給藥方式作用更為顯著。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果提示各治療組大鼠損毀紋狀體區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其產(chǎn)物含量較PD/in增加，其中ICA-PGL/in組顯著促進(jìn)了DA的釋放，增加了紋狀體DA及代謝產(chǎn)物的含量，補(bǔ)充紋狀體DA的不足，增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)功能，從而改善PD模型大鼠的運(yùn)動(dòng)功能。

本研究提示淫羊藿苷脂質(zhì)體結(jié)合經(jīng)鼻給藥方式可能通過(guò)保護(hù)黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元，提高紋狀體區(qū)多巴胺能神經(jīng)元纖維的表達(dá)和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量，進(jìn)一步改善PD大鼠運(yùn)動(dòng)功能。

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（收稿日期：2018-09-25）