沒食子兒茶素沒食子酸酯對脂肪細胞吸收葡萄糖的影響

張偉云，張 勇，徐晶晶，向云亞，陳全成

(1.廈門醫學院藥學系，福建 廈門 361023；2.廈門醫學院機能與臨床轉化福建省高等學校重點實驗室，福建廈門 361023；3.廈門大學 藥學院，福建 廈門 361102)

降血糖作用是衡量某活性物質是否具有防治2型糖尿病能力的重要標準之一，選擇快速、直接、客觀、嚴謹的細胞葡萄糖吸收檢測方法用以評估待測化學成分的降血糖活性具有十分重大的意義。葡萄糖熒光示蹤劑2-[N-(7-硝基苯-2-氧代-1,3-重氮基-4-基)氨基]-2-脫氧-D-葡萄糖(2-NBDG)在467 nm波長被激發時，于542 nm波長處產生強烈的熒光，采用2-NBDG作為葡萄糖示蹤劑，利用流式細胞儀直接檢測單細胞吸收葡萄糖的方法[1]，不但克服了放射性示蹤劑無法測定單細胞吸收葡萄糖的缺點，同時也避免了放射性廢物處理的問題[2]，并且能夠客觀、快速、高效地獲取試驗數據。

3T3-L1前脂肪細胞被誘導分化為成熟的脂肪細胞后能促進外部環境中的葡萄糖消耗。胰島素、胰島素類似物與不同酶和受體相互作用，通過激活細胞和細胞核中的多個信號通路，進而加速成熟脂肪細胞對周圍葡萄糖的吸收、運輸、消耗，最終使細胞培養基中葡萄糖濃度降低。因而，3T3-L1前脂肪細胞系已被廣泛應用于降糖藥物篩選模型[3-5]。

研究表明，油茶醇提取物可在一定程度上降低2型糖尿病小鼠的血糖濃度[6]，前期研究提示油茶醇提取物中的沒食子兒茶素沒食子酸酯很可能會在一定程度上加快細胞吸收葡萄糖。因此，本研究以羅格列酮為對照藥，對沒食子兒茶素沒食子酸酯在3T3脂肪細胞中對葡萄糖吸收的影響及其對3T3-L1前脂肪細胞分化的作用進行了考察。

1 材料與儀器

1.1 藥品

葡萄糖、胰島素、羅格列酮均購買于Sigma-Aldrich； 沒食子兒茶素沒食子酸酯(純度>98%)購買于成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.2 試劑

油紅O、蘇木精-伊紅溶液均購自Sigma-Aldrich；葡萄糖熒光示蹤劑2-NBDG購自Molecular Probes。其他化學試劑均為分析純。

1.3 儀器

試驗中使用的主要儀器包括全波長酶標儀(Multiskan Go，美國賽默飛世爾科技有限公司); 流式細胞儀(FACS Calibur flowcytometer，美國Becton Dickinson公司); CO2恒溫培養箱(IFS-110-8，新加坡Esco Micro Pte有限公司)。

1.4 細胞

小鼠源3T3-L1前脂肪細胞購自美國菌種保藏中心(ATCC)，用10%胎牛血清DMEM在5%CO2加濕空氣的細胞培養箱中于37℃進行培養，第5～9代細胞用于實驗。

2 方法

2.1 細胞活力測定

使用MTT法檢測，采用含有0.5 μM和1 μM沒食子兒茶素沒食子酸酯或羅格列酮的無血清DMEM處理48 h后，觀察3T3-L1前脂肪細胞的生長及增殖的情況，于酶標儀490 nm波長下測定各組光密度值，設置空白對照組細胞對應的光密度值為100%。

2.2 沒食子兒茶素沒食子酸酯對脂肪細胞吸收葡萄糖的影響

參照文獻方法操作[7-15]，通過流式細胞儀測定沒食子兒茶素沒食子酸酯對葡萄糖熒光示蹤劑2-NBDG吸收的影響。以1×104個細胞/孔的密度，將分化的3T3-L1脂肪細胞種于96孔細胞培養板，于含1 μM胰島素的無血清高濃度葡萄糖(30 mM)的DMEM中培養24 h，再分別用0.5 μM和1 μM的沒食子兒茶素沒食子酸酯及羅格列酮和10 μM 2-NBDG處理1 h，對照組則用無血清DMEM處理1 h。將收集的各組細胞懸浮于預冷的500 μL無血清但含高濃度葡萄糖(30 mM)的DMEM中，保持在4 ℃，用流式細胞儀分析細胞吸收葡萄糖的情況，記錄各組細胞吸收2-NBDG的熒光強度值。用沒食子兒茶素沒食子酸酯或羅格列酮處理但未加2-NBDG進行處理的對照組的細胞熒光強度分別作為其測量背景值，以排除假陽性。統計藥物處理組的熒光強度值與背景值之差，以作后續數據分析。

2.3 油紅O染色和脂積累量測定

參照文獻[7-15]誘導3T3-L1前脂肪細胞分化。按照4×103細胞/孔的密度，將3T3-L1前脂肪細胞種于96孔細胞培養板，培養24 h后，再用含1 μM胰島素和0.5 μM及1 μM的沒食子兒茶素沒食子酸酯或羅格列酮的培養基繼續培養3 d，對照組細胞則用含1 μM胰島素的培養基培養3 d，12天后，進行油紅O染色和脂含量測定。用10%福爾馬林溶液固定各組細胞1 h后，在室溫下用油紅O溶液染色2 h，接著用蘇木精-伊紅染色15 min。為了去除游離染料，用60%異丙醇溶液輕柔清洗各組細胞3次。應用全波長酶標儀在510 nm波長下測定各組細胞的脂積累量。在光學顯微鏡下拍攝(400×)各組細胞油紅O的染色情況，用以對比和評估沒食子兒茶素沒食子酸酯對3T3-L1前脂肪細胞分化過程的影響。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 沒食子兒茶素沒食子酸酯對3T3-L1前脂肪細胞活力的影響

以空白對照組細胞光密度值為100%，與空白對照組相比，沒食子兒茶素沒食子酸酯和羅格列酮在0.5 μM和1 μM濃度下均對3T3-L1前脂肪細胞的生長和增殖沒有顯著影響，提示沒食子兒茶素沒食子酸酯和羅格列酮對3T3-L1前脂肪細胞無細胞毒性，不破壞細胞的生長和增殖。如圖1所示。

圖1 沒食子兒茶素沒食子酸酯對3T3-L1前脂肪細胞活力的影響(n=6)

3.2 沒食子兒茶素沒食子酸酯對葡萄糖吸收的影響

采用3T3-L1前脂肪細胞分化模型，測定沒食子兒茶素沒食子酸酯在3T3-L1脂肪細胞中對胰島素刺激的葡萄糖熒光示蹤劑2-NBDG吸收的作用。與對照組相比，0.5 μM和1 μM羅格列酮可顯著促進在高濃度葡萄糖(30 mM)條件下3T3-L1脂肪細胞中胰島素刺激的葡萄糖吸收(圖2)。沒食子兒茶素沒食子酸酯在1 μM的濃度下也可顯著增加3T3-L1脂肪細胞對胰島素調節的2-NBDG吸收，并且比1 μM羅格列酮體現出更強的趨勢。

注：n=6, 與對照組比較，** P< 0.01。

3.3 沒食子兒茶素沒食子酸酯對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響

相對于空白對照組3T3-L1前脂肪細胞(圖 3A)，對照組細胞(圖 3B)受到胰島素的影響出現了少量成熟的脂肪細胞，新生成的成熟脂肪細胞被油紅O染成紅色。與對照組細胞(圖 3B)相比，1 μM羅格列酮可明顯加速脂肪分化，出現了較多成熟的脂肪細胞(圖 3D)，還可促進脂積累(圖4)。在1 μM的濃度下，沒食子兒茶素沒食子酸酯也體現出與羅格列酮相似的活性，可明顯促進脂肪分化(圖3F)，顯著增加脂含量(圖4)。

注：(A)空白組；(B)胰島素處理組；(C)0.5 μM羅格列酮處理組；(D)1 μM羅格列酮處理組；(E)0.5 μM沒食子兒茶素沒食子酸酯處理組；(F)1 μM沒食子兒茶素沒食子酸酯處理組。

圖3 沒食子兒茶素沒食子酸酯對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響

注：n=6，設定對照組中脂的含量為100%；與對照組比較，**P<0.01。

圖4 沒食子兒茶素沒食子酸酯對3T3-L1前脂肪
細胞分化過程中脂含量的影響

4 討論

沒食子兒茶素沒食子酸酯可顯著提高分化的3T3-L1脂肪細胞在高濃度葡萄糖條件下對胰島素刺激條件下的葡萄糖吸收，這表明沒食子兒茶素沒食子酸酯可能具有降低血糖的潛能，但需要深入研究其作用機制。

上調過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)表達能顯著提高胰島素敏感性[16-18]。PPARγ2選擇性表達于脂肪細胞中，其表達離不開脂肪細胞分化過程[19]。因此，能夠促進脂肪細胞分化的化合物很可能具有改善胰島素敏感性和提高胰島素刺激的葡萄糖吸收的潛力[7-15]。試驗結果提示沒食子兒茶素沒食子酸酯促進了3T3-L1前脂肪細胞的分化過程，這可能是沒食子兒茶素沒食子酸酯加快脂肪細胞中胰島素刺激的葡萄糖吸收的一個原因，但這仍需進一步研究。

5 結語

綜上所述，沒食子兒茶素沒食子酸酯不僅促進了分化的3T3-L1脂肪細胞對胰島素刺激的葡萄糖吸收，而且加速了3T3-L1前脂肪細胞的分化過程。因此，沒食子兒茶素沒食子酸酯可能具有降低血糖和改善胰島素抵抗的潛能，這對于預防或輔助治療2型糖尿病具有重要意義。