基于p38 MAPK信號通路研究養陰潤目丸治療 干眼兔的作用機制

李玲 李點 李玲 袁娉 黃家望

〔摘要〕 目的 探討基于p38 MAPK信號通路研究養陰潤目丸治療干眼兔的作用機制。方法 采用氫溴酸東莨菪堿皮下注射途徑制備干眼兔模型，按隨機數字表法分成模型組、p38抑制劑組、陽性藥物（杞菊地黃丸）組和低、中、高劑量養陰潤目丸組，同步設不造模的正常組，6只/組。各組按相應處理方式連續干預2周后，檢測各組兔淚液分泌量、淚腺病理形態、淚腺組織凋亡細胞的表達及淚腺組織中p38 MAPK、Bax、Bcl-2蛋白和mRNA表達情況。結果 養陰潤目丸組和陽性藥物組能增加干眼兔模型淚液分泌量，抑制淚腺細胞的凋亡，下調p38 MAPK、Bax的蛋白和mRNA表達，上調Bcl-2的蛋白和mRNA表達水平，與模型組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論 養陰潤目丸能夠通過糾正Bax/Bcl-2失衡，改善干眼淚腺細胞凋亡，進而減輕淚腺細胞損傷，恢復淚腺細胞的代謝功能，與調控p38 MAPK的關系極為密切，這可能是其治療干眼的重要機制之一。

〔關鍵詞〕 干眼;養陰潤目丸;淚腺;細胞凋亡;p38 MAPK

〔中圖分類號〕R285.5;R777? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.10.004

Study on the Mechanism of Yangyin Runmu Pills in the Treatment of Rabbit with

Dry Eye Based on p38 MAPK Signaling Pathway

LI Ling1， LI Dian2*， LI Ling3， YUAN Ping1， HUANG Jiawang1

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 3. Jiangmen Wuyi Hospital of Traditional Chinese Medicine， Jiangmen， Guangdong 529000， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the mechanism of Yangyin Runmu Pills in the treatment of rabbit model with dry eye based on p38 MAPK signaling pathway. Methods Dry eye rabbit models were established by subcutaneous injection of scopolamine hydrobromide. According to random number table method， they were divided into model group， p38 inhibitor group， positive medicine （Qiju Dihuang Pills） group， low， medium and high dose Yangyin Runmu Pills groups， and normal group without modeling， 6 rabbits/group. After 2 weeks of continuous intervention， lacrimal secretion volume， pathological morphology of lacrimal gland， expression of apoptotic cells in lacrimal gland tissue， as well as expressions of p38 MAPK， Bax and Bcl-2 protein and mRNA in lacrimal gland tissue were detected. Results In the Yangyin Runmu Pills groups and the positive medicine group， the lacrimal secretion volume was increased， the apoptosis of lacrimal gland cells was inhibited， the expressions of p38 MAPK， Bax protein and mRNA were down-regulated， and the expression levels of Bcl-2 protein and mRNA were up-regulated， which were significantly different from those in the model group （P<0.05）. Conclusion Yangyin Runmu Pills can improve the apoptosis of dry eye lacrimal gland cells by correcting the imbalance of Bax/Bcl-2， thereby alleviating the damage of lacrimal gland cells and restoring the metabolic function of lacrimal gland cells， and it is closely related to the regulation of p38 MAPK， which may be one of the important mechanisms in the treatment of dry eye.

〔Keywords〕 dry eye; Yangyin Runmu Pills; lacrimal gland; cell apoptosis; p38 MAPK

干眼是指任何原因造成的一種淚液（質或量異常）和眼表疾病，包括眼表不適癥狀，視力變化和淚膜不穩定，并伴隨淚液滲透壓升高和眼表炎癥反應為特征的多種疾病的總稱[1]，這種損傷日久則可造成角結膜病變，并會影響視力，嚴重干眼可引起視力明顯下降從而影響患者正常的工作和生活，甚至導致失明。隨著現代生活使用電腦、電視、游戲機等終端屏幕的普及，環境中煙塵等顆粒物的污染，年齡、激素水平的影響，眼部創傷史、用藥史及手術史，以及因年齡、性激素水平和自身免疫性疾病等因素引起的眼局部病變，使干眼的發病率呈逐年升高趨勢[2]。

本課題組多年臨床實踐治療干眼的經驗方養陰潤目丸已成為湖南中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑[3-5]。本項目在前期研究的基礎上，擬通過養陰潤目丸干預氫溴酸東莨菪堿皮下注射途徑建立的淚液缺乏性干眼兔模型，檢測p38 MAPK蛋白和基因的表達特點及與淚腺細胞凋亡的規律，從新的視角闡釋干眼發病、發展的可能機制以及養陰潤目丸的干預作用。

1 實驗材料

1.1? 主要儀器

Synergy2多功能酶標儀（美國Bio-Tek）;IQ5實時定量PCR儀，Western blot系統，ChemiDoc XRS+化學發光成像分析系統（美國Bio-Rad）。

1.2? 藥品及主要試劑

養陰潤目丸是湖南中醫藥大學第一附屬醫院眼科治療干眼的院內制劑，規格為1 g丸劑相當于 8.4 g生藥;杞菊地黃丸（九芝堂股份有限公司，201505001）;氫溴酸東莨菪堿注射液（成都第一藥業，H51022122，

10 mg/支）;p38 MAPK抑制劑SB203580（selleck，S1076）;逆轉錄試劑盒（A3500）、qPCR mix（A6001），均來自美國promega;p38 MAPK、Bax、Bcl-2和β-actin引物（生工）;Trizon Reagent（CW0580）、RIPA蛋白裂解液（CW2334S）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（CW0014S）、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（CW0022）、彩色預染蛋白marker（CW2307M）、ECL發光檢測試劑盒（CW0048M），均來自江蘇康為世紀公司;Tunel細胞凋亡檢測試劑盒（bs-8004-10）、p38 MAPK（bs-5476R）、Bax（bs-20386R）、Bcl-2（bs-4563R）、β-actin（bs-0061R），均來自北京BIOSS公司;HRP標記的羊抗鼠二抗（SA00001-1）、HRP標記的羊抗兔二抗（SA00001-2）均來自美國Proteintech。

1.3? 實驗動物

健康普通級新西蘭兔，雌雄各半，體質量2.0～2.5 kg，由湖南景萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002，由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供飼養條件，在自由飲食、光/暗周期為 12 h/12 h（光照時間為6：00-18：00）、背景噪音為（40±10） db、溫度（20±3） ℃的條件下飼養。

2 實驗方法

2.1? 動物分組和藥物干預

采用隨機數字表法將70只實驗兔隨機分成7組，10只/組，分別為正常組，模型組、p38抑制劑組、陽性藥物組和養陰潤目低、中、高劑量組（簡稱養潤低、中、高劑組）。除正常對照組外，各實驗兔均參照劉雪[6]的水液缺乏型干眼模型制作，通過氫溴酸東莨菪堿皮下注射4次/d，劑量2.0 mg/kg，持續28 d。干眼模型建立后，p38抑制劑組給予p38通路抑制劑SB203580皮下注射0.1 mg/（kg·d），陽性藥物組給予杞菊地黃丸0.782 g/（kg·d）灌胃，養陰潤目丸低、中、高劑量組分別給予0.782、0.869、1.738 g/（kg·d）灌胃，正常組和模型組灌胃等量生理鹽水，連續給藥2周后，進行相應指標檢測。

2.2? 指標檢測

2.2.1? Schirmer試驗檢測淚液分泌量? 根據Tsutomu Fujihara報道[7]采用改良的Schirmer試驗，將試紙前段5 mm反折于兔下眼瞼顳側結膜囊，其余部分懸垂于皮膚表面，檢測記錄5 min后試紙淚液浸濕長度（不包括反折部分的長度），記為基礎淚腺分泌試驗（Schirmer i test，SIT）長度。

2.2.2? HE法檢測淚腺組織病理變化? 分離淚腺組織，4%多聚甲醛中固定、梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，間斷連續5 μm厚切片，HE染色、脫水、透明、封片。光學顯微鏡下觀察淚腺的病理學改變并拍照。

2.2.3? Tunel法檢測淚腺組織細胞凋亡情況? 取病理形態檢測用蠟塊切片，常規脫蠟，Tunel法檢測淚腺組織細胞凋亡情況，Motic B5顯微攝像系統進行攝像。隨機統計各組5～7個高倍視野（×400倍）中的凋亡細胞總數，計算每高倍視野下的平均凋亡細胞數。

2.2.4? Western-blot法檢測淚腺組織p38 MAPK、Bax和Bcl-2蛋白的表達 取兔淚腺組織于勻漿器中，剪碎，加400 μL單去污劑裂解液裂（含PMSF）進行勻漿，冰上30 min后4 ℃下12 000 r/min離心5 min，取上清應用BCA法測定蛋白濃度;取50 μg總蛋白上樣，進行SDS-PAGE電泳，轉膜后，封閉處理1 h，加入一抗p38 MAPK、Bax、Bcl-2和β-actin兔抗鼠多克隆抗體（1∶1 000），孵育過夜，二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，暗室加ECL化學發光劑于化學發光儀成像，用圖像分析軟件Image Lab 5.0對圖像進行信號分析，并計算目的蛋白/β-actin蛋白的比值。

2.2.5? Real-time PCR法檢測淚腺組織p38 MAPK、Bax和Bcl-2基因的表達? 取兔淚腺組織Trizol法提取各組淚腺組織總RNA，并逆轉錄合成cDNA，以此cDNA為模板用熒光定量PCR試劑盒進行擴增。實驗操作均按相應試劑盒說明書進行。qPCR反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，循環40次。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算各組相對表達量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

2.3? 統計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行統計處理，計量資料以“x±s”表示，首先進行正態性、方差齊性檢驗。滿足正態性者，不同組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），并用LSD法進行組間的多重比較;不滿足正態性時選擇秩和檢驗。先用Kruskal-Wallis H檢驗比較總的差異，再用Mann-Whitney U檢驗進行兩組之間比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1? 養陰潤目丸對干眼癥兔模型淚液分泌量的影響

Schirmer試驗結果顯示：干眼癥兔模型的淚眼分泌明顯減少，與正常組比較，模型組SIT值降低至正常組的50%，差異有統計學意義（P<0.01），符合干眼癥造模標準。各干預組兔的淚眼分泌均有不同程度的增加，與模型組比較，差異有統計學意義（P <0.01）。其中養陰潤目丸呈正相關量效關系趨勢，各干預組組間無差異，見圖1。

3.2? 養陰潤目丸對干眼癥兔模型淚腺組織病理變化的影響

HE病理結果顯示：正常淚腺腺泡大小均勻，結構清楚，腺泡內層為柱狀上皮細胞，可見微絨毛排列有序，胞漿豐富，細胞排列緊密，腺體間質偶見淋巴細胞浸潤。模型組中所示淚腺腺泡內柱狀上皮細胞萎縮，排列紊亂，細胞內物質減少，微絨毛稀疏，腺細胞代謝功能減弱。各干預組兔淚腺形態結構均有不同程度的改善。見圖2。

3.3? 養陰潤目丸對干眼癥兔模型淚腺組織細胞凋亡的影響

Tunel檢測結果顯示：正常兔淚腺細胞存在局灶性、程度輕的凋亡。模型組淚腺腺泡上皮細胞中均可見大量散在的陽性凋亡細胞，呈棕黃色。各干預組兔淚腺細胞凋亡情況均有不同程度的改善。見圖3。

3.4? 養陰潤目丸對干眼癥兔模型淚腺組織p38 MAPK、Bax和Bcl-2蛋白的表達的影響

Western blot結果顯示：正常兔淚腺p38 MAPK和Bax蛋白表達呈低表達，Bcl-2蛋白呈高表達，模型組淚腺組織中p38 MAPK和Bax蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，Bax/Bcl-2失衡，與空白組比較，差異顯著（P<0.01）。藥物干預后各組兔淚腺組織中p38 MAPK和Bax蛋白表達不同程度下調，Bcl-2蛋白表達不同程度上調，與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.01）。其中養陰潤目丸呈正相關量效關系趨勢，各干預組間無差異。見圖4、圖5。

3.5? 養陰潤目丸對干眼癥兔模型淚腺組織p38 MAPK、Bax和Bcl-2 mRNA表達的影響

Real-time PCR檢測結果顯示：正常兔淚腺p38 MAPK和Bax mRNA表達呈低表達，Bcl-2蛋白呈高表達，模型組淚腺組織中p38 MAPK和Bax mRNA表達顯著升高，Bcl-2 mRNA表達水平顯著降低，Bax/Bcl-2失衡，與空白組比較，差異顯著（P<0.01）。藥物干預后各組兔淚腺組織中p38 MAPK和Bax mRNA表達不同程度下調，Bcl-2 mRNA表達不同程度上調，與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.01）。其中養陰潤目丸呈正相關量效關系趨勢，各干預組間無差異。見圖6-8。

4 討論

目前我國干眼患者在3億以上，女性多于男性，年齡在30～40歲人群中干眼的患病率超過20%，70歲以上人群患病率則高達36.1%[8]。因此，加強對干眼的基礎研究和防治工作顯得尤為迫切和重要。淚膜和眼表組織構成了一個復雜的系統，各種刺激如瞬目異常、應激反應、激素失衡和神經機能障礙等均可損傷眼表正常的修復和/（或）防御機制，導致淚腺和眼表組織處于一種慢性炎癥狀態[9-11]。各類炎性細胞的浸潤和細胞炎性因子的釋放，可通過細胞信號轉導通路將信息傳遞至細胞核內，調控相關基因和蛋白的表達，進而對淚腺細胞的生長周期、形態及功能產生影響，而p38 MAPK可由細胞外多種刺激包括炎性因子、應激反應、活性氧等活化，參與細胞的凋亡調控過程[12-14]。目前已有大量研究證實[15-16]，多數細胞炎性因子在干眼發病過程中表達明顯增強，這些炎性因子的表達與釋放與p38 MAPK通路的激活密切相關。我們的前期研究結果也表明p38 MAPK能上調細胞炎性因子如TNF-α、IL-1、IL-6的表達，促進淚腺細胞的凋亡，從而導致淚腺功能障礙，淚液分泌減少。活化的炎性因子可作用于p38 MAPK信號通路進而進一步使自身表達升高，從而加速眼表組織細胞凋亡進程。上述研究結論和前期研究結果提示可通過干預以p38 MAPK為核心的信號轉導通路可抑制干眼狀態下的炎性信號向細胞凋亡進行轉導[17-18]。

干眼在中醫學中屬“白澀癥”范疇，又名“干澀昏花癥”“神水將枯癥”，其病機大多以肝腎不足，津液虧虛，目失潤養為主[19]。故我們在前期研究的基礎上，提出從“肝主淚”學說來探討干眼的防治方法，而“肝主淚”理論認為補養肝腎，則津液充沛，入目為淚，故臨床應以“補養肝腎”為中醫藥治療干眼的基本策略。養陰潤目丸正秉承“肝主淚”基本理論，是湖南中醫藥大學第一附屬醫院眼科治療干眼的院內制劑，已在臨床安全、有效地使用多年，臨床觀察表明養陰潤目丸能有效改善眼表癥狀，消、減角膜染色，增加淚液分泌量。

本研究通過兔皮下注射氫溴酸東莨菪堿的途徑，建立淚液缺乏性干眼模型，在此模型上施加p38抑制劑、陽性藥物杞菊地黃丸和低、中、高劑量養陰潤目丸干預因素，對各組淚液分泌量，淚腺病理形態，淚腺組織凋亡細胞的表達、淚腺組織中p38 MAPK、Bax和Bcl-2蛋白和基因表達情況進行檢測和分析。研究結果表明：干眼兔模型淚液分泌量明顯減少，病理形態顯示上皮細胞萎縮，排列紊亂，細胞內物質減少，微絨毛稀疏，淚腺細胞的凋亡細胞顯著高于正常組，p38 MAPK和Bax的蛋白和mRNA表達顯著升高，Bcl-2的蛋白和mRNA表達水平顯著降低，Bax/Bcl-2失衡。而各干預組能不同程度改善淚腺細胞損傷，其中養陰潤目丸組的干預效果呈劑量相關性（正相關）趨勢。

綜上所述，養陰潤目丸可能通過糾正Bax/Bcl-2失衡，改善干眼淚腺細胞凋亡，進而減輕淚腺細胞損傷，恢復淚腺細胞的代謝功能，且與調控p38 MAPK的關系極為密切，這可能是其治療干眼的重要機制之一，并為中醫學“肝主淚”理論治療干眼的作用提供新的認識。對于中醫藥探索干眼本質特征，以及有效理、法、方劑的提出具有重要的意義。

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