山楂酸對高脂飲食誘導的非酒精性脂肪肝模型小鼠炎癥反應及氧化應激的影響

何峰 張雪蓮 溫祥臣

摘 要 目的：探討山楂酸對高脂飲食誘導的非酒精性脂肪肝（NAFLD）模型小鼠炎癥反應及氧化應激的影響。方法：將72只C57BL/6小鼠隨機分為正常組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、辛伐他汀組（陽性對照，3 mg/kg）和山楂酸低、中、高劑量組（25、50、100 mg/kg），每組12只。正常組小鼠給予標準飼料喂養，其余各組小鼠給予高脂飼料喂養以誘導NAFLD模型。造模同時，各組小鼠灌胃相應劑量的藥物，每天給藥1次，共計給藥12周。末次給藥后12 h，稱量各組小鼠體質量及肝質量，并計算肝指數；全自動生化分析儀測定其血清生化指標[天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙氨酸轉氨酶（ALT）活性及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）含量]變化；蘇木精-伊紅染色后觀察其肝組織病理形態變化；酶聯免疫吸附試驗法檢測其肝組織中炎癥反應指標[核轉錄因子κB（NF-κB）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）含量]和分光光度法測定其中氧化應激指標[丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性]變化。結果：與正常組比較，模型組小鼠肝指數顯著升高（P<0.05）；血清中HDL-C含量顯著降低，其余血清生化指標活性/含量均顯著升高（P<0.05）；肝小葉界限不清晰，肝組織發生明顯病理性改變；肝組織中炎癥反應指標和MDA含量均顯著升高（P<0.05），SOD、GSH-Px活性顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，除山楂酸低劑量組小鼠肝組織中SOD活性升高和MDA含量降低不顯著外（P>0.05），其余各給藥組小鼠上述指標均顯著改善（P<0.05）；肝組織中球形脂滴及炎性細胞浸潤減少。結論：山楂酸可通過抗炎及抑制氧化應激來減輕高脂飲食誘導的NAFLD模型小鼠的肝組織病變程度。

關鍵詞 山楂酸；炎癥反應；氧化應激；非酒精性脂肪肝；高脂飲食；小鼠

Effects of Crataegolic Acid on Inflammatory Response and Oxidative Stress in Non-alcoholic Fatty Liver Disease Model Mice Induced by High-fat Diet

HE Feng，ZHANG Xuelian，WEN Xiangchen（Dept. of Gastroenterology， the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College， Chengdu 610500， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of crataegolic acid on inflammatory response and oxidative stress in non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD） model mice induced by high-fat diet. METHODS： Totally 72 C57BL/6 mice were randomly divided into normal group （normal saline）， model group （normal saline）， simvastatin group （positive control， 3 mg/kg） and crataegolic acid low-dose， medium-dose and high-dose groups （25， 50 and 100 mg/kg）， with 12 mice in each group. Normal group was standard feed， while other groups were given high-fat diet to induce NAFLD model . At the same time of modeling， rats in each group was given relevant dose of drugs intragastrically， once a day， for consecutive 12 weeks. 12 h after last administration， body weight and liver weight of mice were determined， and liver index was calculated. The changes of serum biochemical indexes （activities of AST， ALT and contents of HDL-C， LDL-C， TG， TC） were determined by fully automatic biochemical analyzer. The pathological changes of liver tissue were observed after HE staining. The changes of inflammatory response indexes （contents of NF-κB， TNF-α， IL-6） in liver tissue were determined by ELISA， and the changes of oxidant stress indexes （contents of MDA， SOD and activity of GSH-Px） were determined by spectrophotometry. RESULTS： Compared with normal group， the liver index of mice in model group was increased significantly （P<0.05）. The serum content of HDL-C was decreased significantly， and the activities/contents of other serum biochemical indexes were increased significantly （P<0.05）. The boundary of hepatic lobules was not clear， and the liver tissue had obvious pathological changes. Inflammatory response indexes and the contents of MDA were increased significantly in liver tissue （P<0.05）， the activities of SOD and GSH-Px were decreased significantly （P<0.05）. Compared with model group， except that the increase of SOD activity and the decrease of MDA content of liver tissue were not significantly in crataegolic acid low-dose group （P>0.05）， while above indexes of mice in other administration groups were improved significantly （P<0.05）. The globular lipid droplets and inflammatory cell infiltration were decreased in liver tissue. CONCLUSIONS： Crataegolic acid can effectively alleviate the degree of liver lesions in NAFLD model mice induced by high-fat die through anti-inflammatory and inhibiting oxidative stress.

KEYWORDS Crataegolic acid； Inflammatory response； Oxidative stress； Non-alcoholic fatty liver disease； High-fat diet；mice

非酒精性脂肪肝（NAFLD）以肝臟過量脂肪沉積和肝細胞脂肪變性為主要特征，發病機制排除酒精和其他引起繼發性肝脂肪變性因素[1]。隨著人們飲食習慣的改變及生活水平的提高，肥胖、高血壓、高脂血癥、非胰島素依賴性糖尿病等疾病的發病人數相繼增多，使人群罹患NAFLD的風險逐年增加，且NAFLD還會進一步促使心腦血管事件的發生[2]。NAFLD對社會發展和人類健康構成了嚴重威脅，已成為新的重大健康問題。

山楂酸不僅存在于山楂的葉子和果實中，也存在于橄欖、大花紫薇、水楊梅、藿香、枇杷葉、石榴花等天然植物中，為一種五環三萜酸，具有抗炎、抗氧化、抗2型糖尿病、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理活性[3]。研究表明，山楂酸可以通過抑制核轉錄因子κB（NF-κB）通路以降低致炎因子的釋放，也可以通過增強清除氧自由基的能力，最終起到保護四氯化碳誘導的小鼠急性肝損傷的作用[4]。然而到目前為止，山楂酸對高脂飲食誘導的NAFLD的作用尚未見報道。同時，鑒于炎癥反應及氧化應激在高脂飲食誘導的NAFLD的發生、發展環節中的重要作用[5-6]，本研究以高脂飲食誘導的NAFLD模型小鼠為研究對象，重點探討山楂酸對該模型小鼠炎癥反應及氧化應激的影響，以期為山楂酸臨床治療高脂飲食誘導的NAFLD提供一種新的思路。

1 材料

1.1 儀器

Multiskan GO 1510型全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；EUR-04型高速組織勻漿器（美國Biospec公司）；AB104型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；CX5型全自動生化分析儀（美國Beckman Coulter公司）；L535R型冷凍離心機（湖南湘儀實驗儀器公司）；CM1900型冰凍切片機（德國Leica公司）；UV1900型雙光束紫外-可見分光光度計[讓奇（上海）儀器科技有限公司]。

1.2 藥品與試劑

山楂酸對照品（長沙雅瑩生物科技有限公司，批號：170324，純度：>90%）；辛伐他汀片（貴州天安藥業股份有限公司，批號：20170125，規格：10 mg/片）；NF-κB、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素6（IL-6）檢測試劑盒（北京同立海源生物科技公司，批號：20170426、20170513、20170622）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）檢測試劑盒（上海源葉生物公司，批號：171011、170908、171215）；蘇木精-伊紅（HE）染液（上海歌凡生物科技有限公司）。

1.3 動物

清潔級C57BL/6小鼠72只，♂，4周齡，購于北京維通利華公司，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2017- 0033。小鼠飼養條件為相對濕度50%、溫度23 ℃，按照國家實驗動物飼養標準飼養。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將C57BL/6小鼠適應性飼養1周后，隨機分為正常組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、辛伐他汀組（陽性對照，3 mg/kg）和山楂酸低、中、高劑量組（25、50和100 mg/kg），每組12只。給藥劑量參考王穎等[4]的研究，并結合前期的預實驗結果而設置。正常組小鼠給予標準飼料喂養，其余5組小鼠給予高脂飼料（標準飼料中含0.5%膽酸、2%膽固醇和15%豬油）喂養；同時，各組小鼠灌胃相應劑量的藥物，每天給藥1次，共計給藥12周。

2.2 體質量、肝質量和肝指數測定

末次給藥后12 h，稱量各組小鼠體質量；摘眼球采血后，頸椎脫臼法處死小鼠，分離肝組織，精密稱質量，計算肝指數[肝指數（%）=肝質量/體質量×100%]。

2.3 血清生化指標測定

取“2.2”項下小鼠血液，放于1.5 mL離心管中，離心（3 000 r/min、10 min），分離上清液，采用全自動生化分析儀檢測血清中天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙氨酸轉氨酶（ALT）活性及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）含量。

2.4 肝組織病理形態觀察

取相同部位的小鼠肝組織，在10%甲醛溶液中浸泡24 h，先后經脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋等步驟，隨后在切片機上進行連續5 μm切片，烘干備用。常規方法進行HE染色，光鏡下觀察肝組織病理形態改變情況。

2.5 肝組織炎癥反應及氧化應激指標測定

取相同部位的小鼠肝組織100 g，放入預冷至0 ℃的0.9 mL生理鹽水中，冰水浴下勻漿（3 000 r/min、5 min），得10%肝組織勻漿液。通過酶聯免疫吸附試驗法測定肝組織中炎癥反應指標（NF-κB、TNF-α及IL-6含量），分光光度法測定肝組織中氧化應激指標（SOD、GSH-Px活性及MDA含量），相關操作嚴格按照相應試劑盒說明書操作指南進行。

2.6 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對所得數據進行統計分析。采用Shapiro-Wilk法檢驗正態性，Levene法檢驗方差齊性；符合正態分布且方差齊性的計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05表明差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 山楂酸對模型小鼠體質量、肝質量和肝指數的影響

與正常組比較，模型組小鼠體質量、肝質量及肝指數均明顯升高（P<0.05），提示模型建立成功；與模型組比較，山楂酸各劑量組及辛伐他汀組小鼠體質量差異均無統計學意義（P>0.05），而肝質量和肝指數均顯著降低（P<0.05）。各組小鼠體質量、肝質量和肝指數測定結果見表1。

3.2 山楂酸對模型小鼠血清中AST和ALT活性的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清中AST、ALT活性顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，山楂酸各劑量組及辛伐他汀組小鼠血清中AST、ALT活性均顯著降低（P<0.05）。各組型小鼠血清中AST和ALT活性測定結果見表2。

3.3 山楂酸對模型小鼠血清中HDL-C、LDL-C、TG和TC含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清中HDL-C含量顯著降低（P<0.05），而LDL-C、TG和TC含量均顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，山楂酸各劑量組及辛伐他汀組小鼠血清中HDL-C含量均顯著升高（P<0.05），而LDL-C、TG和TC含量均顯著降低（P<0.05）。各組小鼠血清中HDL-C、LDL-C、TG和TC含量測定結果見表3。

3.4 山楂酸對模型小鼠肝組織病理形態的影響

正常組小鼠肝小葉結構清晰，肝組織結構正常，周圍細胞索呈放射狀排列，無脂肪變性細胞，細胞質均勻；模型組小鼠肝小葉界限不清晰，肝組織結構發生病理性改變，出現大量球形脂滴，炎癥細胞浸潤；與模型組比較，山楂酸各劑量組及辛伐他汀組小鼠肝組織病理形態得到一定程度改善，球形脂滴及炎癥細胞浸潤減少，其中尤以山楂酸高劑量組及辛伐他汀組小鼠改善更為明顯。各組小鼠肝組織病理觀察結果見圖1。

3.6 山楂酸對模型小鼠肝組織中SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px活性顯著減低（P<0.05），MDA含量顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，山楂酸中、高劑量組和辛伐他汀組小鼠肝組織中SOD活性及山楂酸各劑量組、辛伐他汀組小鼠肝組織中GSH-Px活性均顯著升高（P<0.05），山楂酸中、高劑量組和辛伐他汀組小鼠肝組織中MDA含量均顯著降低（P<0.05）。各組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px活性及MDA含量測定結果見表5。

4 討論

脂肪代謝主要發生在肝臟，長期大量的高脂飲食會增加肝對脂肪的攝取，當肝臟中的脂肪攝取速度大于排出時，會導致肝脂肪變性。高脂飲食飼養誘導的動物模型可以較好地模擬人類NAFLD的發生、發展過程，且具有胰島素抵抗、肥胖等特征，應用廣泛[7]。辛伐他汀可以抑制內源性膽固醇合成，為羥甲戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，是臨床上治療高脂血癥的常用藥物，在NAFLD相關研究中也經常作為陽性藥使用[8]。在本研究中，高脂飲食飼養小鼠12周后，模型組小鼠體質量、肝質量及肝指數均明顯升高，肝組織出現大量的脂滴，并出現炎性細胞浸潤，提示建模成功。而山楂酸各劑量組小鼠肝質量及肝指數均顯著下降，且肝組織病理形態得到一定程度改善，表明山楂酸具有保護高脂飲食誘導的NAFLD小鼠肝臟病變的作用。血清中AST、ALT活性及HDLC、LDLC、TG、TC含量是反映NAFLD最常用的指標[9]。本研究結果也發現，山楂酸可以降低模型小鼠血清中AST、ALT活性及L-DLC、TG、TC含量，升高H-DLC含量，此結果進一步證實了山楂酸對高脂飲食誘導的NAFLD模型小鼠肝病變的保護作用。

炎癥反應在NAFLD的發生、發展中發揮重要作用，而NF-κB、TNF-α及IL-6與炎癥反應的發生密切相關[10]。NF-κB、TNF-α及IL-6等炎癥細胞因子能促進肝細胞脂肪變性、外周脂肪分解、壞死、凋亡及炎癥，最終導致NAFLD的發生[11]。NF-κB可以被食物中的游離脂肪酸（FFA）激活，進而促進TNF-α、IL-6等炎癥細胞因子表達的增加，引起脂肪性肝損傷。一項關于護肝清脂片緩解NAFLD的機制的研究表明，抑制NF-κB活性進而減輕肝細胞炎癥反應是其緩解NAFLD進程的機制之一[12]。唐彬等[13]研究發現，黃芩苷對高脂飲食誘導的脂肪肝大鼠肝組織炎癥損傷和肝細胞變性有較好的改善作用，其機制與TNF-α及IL-6等炎癥因子的表達被抑制有關。本研究同樣發現，模型組小鼠肝組織中NF-κB、TNF-α及IL-6含量明顯升高，而山楂酸各劑量組小鼠肝組織中NF-κB、TNF-α及IL-6含量顯著降低，此結果提示山楂酸可以有效抑制高脂飲食誘導的NAFLD小鼠肝組織的炎癥反應。

氧化應激是指機體內活性氧簇（ROS）產生速度加快，超出清除能力，進而導致組織損傷，是NAFL的發病機制之一[14]。肝既是ROS產生的主要場所，也是ROS攻擊的主要靶器官。SOD能夠避免體內ROS濃度過高時引起的不良反應，是一種重要的ROS清除劑，可以使機體內的ROS處于平衡狀態。在NAFLD模型中，SOD活性明顯降低，使ROS累積增多，最終加重肝細胞損傷[15]。GSH-Px在人體各組織中均存在，其中以肝組織中GSH-Px的活性最高，是內源性抗氧化系統的重要組成部分，具有清除ROS及防止肝氧化應激損傷的作用。一項關于糖肝康對NAFLD模型大鼠肝損傷的保護作用的研究表明，其能夠通過提高GSH-Px的活性，發揮對NAFLD模型大鼠肝臟損傷的保護作用[16]。MDA半壽期較ROS長，是一種強毒力的脂質過氧化產物，能擴散到細胞內、外其他靶位，進而加重氧化應激的損害范圍。研究表明，NAFLD患者MDA含量明顯增高，并且與肝組織脂化、纖維化、炎癥及壞死程度正相關[17]。SOD、GSH-Px活性及MDA含量，三者通常互相配合反映機體發生氧化損傷的程度[18]。本研究發現，模型組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px活性顯著降低，而MDA含量顯著升高，表明模型小鼠肝組織存在氧化損傷；而山楂酸各劑量組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px活性均顯著升高，MDA含量均顯著降低，這提示山楂酸可以有效抑制高脂飲食誘導的NAFLD模型小鼠肝組織氧化應激水平。

綜上所述，山楂酸可通過抗炎及抑制氧化應激水平，有效改善高脂飲食誘導的NAFLD模型小鼠的肝病變程度，但具體的分子機制還有待深入研究。

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（收稿日期：2018-12-14 修回日期：2019-01-12）

（編輯：林 靜）