梔子苷對酵母多糖致大鼠腸黏膜屏障損害作用的研究

鄧怒驕　陳凌波　譚瑛子　蘭斌　鄧常清　張文興

〔摘要〕 目的 探討梔子苷對酵母多糖（zymosan， Zym）致大鼠腸黏膜屏障損害的作用。方法 通過腹腔注射Zym-石蠟混懸液建立大鼠腸黏膜屏障損害模型，將模型大鼠隨機分為模型組、梔子苷組、烏司他丁組， 腹腔注射Zym后即刻干預，12 h后重復干預 1 次。另設正常對照組。造模24 h后測定大鼠血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白介素-6（interleukin-6， IL-6）、白介素-10（interleukin-10， IL-10）、D-乳酸（D-lactate， D-LA）、二胺氧化酶（diamine oxidase， DAO）、內毒素（endotoxin， ET）水平，并取小腸進行病理組織學檢查。結果 模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、D-LA、DAO、ET水平較正常對照組顯著增高（P<0.01）;病理組織學檢查可見黏膜上皮水腫，黏膜上皮細胞排列紊亂，黏膜上皮炎癥細胞增多，固有層松散、充血;與模型組比較，梔子苷可降低腸黏膜屏障損害大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、D-LA、DAO及ET水平，增加IL-10水平（P<0.05， P<0.01），減輕腸組織病理性損傷。結論 梔子苷可以減輕Zym導致的大鼠炎癥反應，對Zym引起的腸黏膜屏障損害具有保護作用。

〔關鍵詞〕 梔子苷;酵母多糖;腸黏膜屏障;炎癥反應

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.04.007

Effects of Geniposide on Intestinal Mucosal Barrier Damage Induced by Zymosan in Rats

DENG Nujiao， CHEN Lingbo， TAN Yingzi， LAN Bin， DENG Changqing， ZHANG Wenxing*

（Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of geniposide on intestinal mucosal barrier damage induced by zymosan （Zym） in rats. Methods Intestinal mucosal barrier damage model of rats was induced by intraperitoneal injection of zymosan-paraffin suspension. The model rats were randomly divided into the model group， geniposide group and ulinastatin group. Drugs were given after intraperitoneal injection of zymosan-paraffin suspension immediately and 12 h later. The normal control group was set up. Then， 24 h after modeling， the levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， interleukin-10 （IL-10）， D-lactate （D-LA）， diamine oxidase （DAO）， and endotoxin （ET） in the serum were measured， and the intestines of rats were taken for histopathological examination. Results The levels of TNF-α， IL-1β， IL-6， IL-10， D-LA， DAO， and ET in the serum in the model group were significantly higher than those in the normal control group （P<0.01）. The pathological examination showed intestinal mucosal epithelial edema， disordered arrangement of mucosal epithelial cells， increased mucosal epithelial inflammatory cells， congestive lamina propria. Geniposide could decrease the levels of TNF-α， IL-1β， IL-6， D-LA， DAO and ET， and increase the IL-10 level （P<0.05， P<0.01）， reduce pathological damage in intestinal tissue. Conclusion Geniposide could reduce inflammatory reaction， attenuate the intestine mucosal damage induced by zymosan in rats.

〔Keywords〕 geniposide; zymosan; intestinal mucosal barrier; inflammatory response

腸黏膜屏障是指腸道能夠防止腸內的有害物質如細菌、毒素等穿過腸黏膜，進而進入到人體內的其他組織器官和血液循環的總和[1]。當機體處于嚴重感染、休克等應急狀態時，一方面可通過腸道菌群失調、內毒素、缺血-再灌注損傷、釋放炎癥介質等機制損傷腸道黏膜，使得腸黏膜的通透性升高，導致腸道細菌以及內毒素的移位，啟動或加重了炎癥介質的瀑布效應，從而導致失控性全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome， SIRS），進一步發展成為多器官功能障礙綜合癥（multiple organ dysfunction syndrome， MODS），另一方面，在上述病理狀態下，胃腸道能直接產生和釋放多種腸源性炎癥介質，更進一步放大全身炎癥反應[2]，因此，對腸黏膜的屏障功能加以保護，減少炎癥介質的釋放，對于SIRS和MODS的防治具有重要的臨床意義。梔子苷（geniposide）是清熱藥梔子（Gardenia jasminoides Ellis）的主要活性成分，研究表明梔子苷具有廣泛的抗炎作用[3]，梔子苷在體外對脂多糖（lipopolysaccharides， LPS）具有顯著的直接中和作用[4]，可減少LPS刺激巨噬細胞引起的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6， IL-6）的分泌，增加白細胞介素-10（interleukin-10， IL-10）的生成，可減輕LPS引起的小鼠急性肺損傷、小鼠乳腺炎及大鼠神經小膠質細胞炎癥[5-8]，對膿毒癥模型的小鼠具有顯著的保護作用[4]。但有關梔子苷對酵母多糖（zymosan， Zym）誘導腸黏膜屏障損害的作用尚未見報道，因此，本文研究梔子苷對Zym誘導的腸黏膜屏障損傷的作用，旨在為臨床應用提供部分實驗依據。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠，4月齡，體質量220～270 g，由湖南斯萊克景達實驗動物公司提供，動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002。大鼠飼以標準顆粒飼料，12 h交替光線照明，室內通風良好，室溫20～25 ℃，相對濕度40%～50%。

1.2? 試劑及藥品

梔子苷：批號HL-171219，質量分數98.1%，由西安匯林生物科技有限公司提供;注射用烏司他丁：批號031610054，規格10萬U/支，由廣東天普生化醫藥股份有限公司提供;酵母多糖：Sigma公司產品（Z4250-5G）批號BCBK3273V;TNF-α（批號2401450615）、IL-10（批號1381455615）、EL-6（批號1331415615）、IL-β（批號1151458615）ELISA試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供;D-乳酸（D-lactate， D-LA）（批號06/2018）由上海酶聯生物科技有限公司提供;二胺氧化酶（diamine oxidase， DAO）（批號V18032498）、內毒素（endotoxin， ET）（批號T11032497）由武漢華美生物工程有限公司提供;醫用液體石蠟：批號101520170602，由湖南爾康制藥股份有限公司提供。

1.3? 儀器

H1650R臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司生產;PW-812全自動酶標洗板機、MB-530多功能酶標分析儀：深圳市匯松科技發展有限公司生產;DHP-500恒溫培養箱：北京市永光明醫療儀器有限公司生產;LEICADMLB2型雙目顯微鏡：德國LEICA公司產生產;Shandon325石蠟切片機：英國Shandon公司生產。

1.4? 模型制備及干預

按文獻方法[9]將Zym粉劑10 g加至100 mL液體石蠟中（濃度為100 mg/mL），先用磁力攪拌器攪拌均勻，再用高頻電動振蕩器混勻制成懸濁液，置于100 ℃水浴消毒80 min，冷卻后放入4 ℃冰箱備用，使用前將懸濁液加熱至40 ℃，搖勻后使用。實驗前10 h，SD大鼠開始禁食，造模前1 d，將SD大鼠稱體質量后標記，模型組及各給藥組大鼠均按體質量腹腔注射Zym 500 mg/mL，正常對照組腹腔注射等容量的液體石蠟，注射后輕揉腹部。大鼠腹腔注射Zym后即刻干預，12 h后重復干預1次。梔子苷組灌胃給予梔子苷40 mg/kg，陽性對照組腹腔注射烏司他丁27 000 U/kg，給藥體積均為10 mL/kg，模型組及正常對照組灌胃給予等容量0.5%羧甲基纖維素鈉。

1.5? 標本采集及指標檢測

大鼠腹腔注射Zym或液體石蠟24 h后，用 10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉后腹主動脈取血約8 mL，分離血清，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠血清D-LA、DAO、ET、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10表達水平。處死大鼠后，距回盲部5 cm處取約3 cm回腸末端腸管，置于10%中性甲醛中固定，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，進行病理組織學檢查。

1.6? 統計學分析

實驗數據“x±s”表示，應用SPSS 17.0 統計軟件進行統計分析，各組間數據經方差齊性檢驗后，兩組間比較采用單因素方差分析。檢驗水平α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1? 梔子苷對腸黏膜屏障損傷大鼠腸道病理組織學的影響

正常對照組大鼠末端回腸黏膜結構完整，絨毛排列整齊、緊密，杯狀細胞數量中等，無炎癥細胞浸潤;模型組大鼠腹腔注射Zym 24 h后可見小腸黏膜明顯水腫，黏膜上皮細胞排列紊亂，黏膜上皮輕度脫落，固有層充血，杯狀細胞減少，炎癥細胞增多。梔子苷組、烏司他丁組腸黏膜輕度水腫，固有層充血減輕，杯狀細胞增多，炎癥細胞浸潤減輕。見圖1。

2.2? 梔子苷對腸黏膜屏障損傷大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10水平的影響

模型組大鼠腹腔注射Zym 24 h后血清TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10水平明顯高于正常對照組（P<0.01）;梔子苷組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯低于模型組（P<0.05，P<0.01），IL-10水平明顯高于模型組（P<0.01）;烏司他丁組大鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-6水平明顯低于模型組（P<0.01），IL-10明顯高于模型組（P<0.01）。見圖2。

2.3? 梔子苷對腸黏膜屏障損傷大鼠血清D-LA、DAO及ET的影響

模型組大鼠腹腔注射Zym 24 h后血清D-LA、DAO及ET水平明顯高于正常對照組（P<0.01），梔子苷組大鼠血清D-LA、DAO及ET水平明顯低于模型組（P<0.01），烏司他丁組大鼠血清D-LA、DAO及ET水平明顯低于模型組（P<0.01）。見圖3。

3 討論

Zym腹腔注射通過激活補體系統、刺激巨噬細胞釋放大量炎性介質，引起無菌性腹腔炎癥，從而導致全身性炎癥反應以及有效循環血量的減少[10-11]，在腸組織中局部過強的炎癥反應以及血流量的減少，均可削弱腸屏障的功能，進而增加腸黏膜的通透性，并導致腸內毒素和細菌的移位，從而進一步加重了全身性的炎癥反應，甚至可引發MODS。

TNF-α是最早引起全身炎癥反應甚至MODS的炎性介質，也是導致炎性介質級聯反應的始發因子;SIRS的啟動因子IL-1β，也發揮著與TNF-α相類似的作用，因此，血中TNF-α、IL-1β的水平與SIRS、MODS的發生以及嚴重程度有著很好的相關性。IL-6作為炎癥反應的主要誘導者，能夠直接反映出各種類型損害的嚴重程度。IL-10作為主要的抗炎因子，可抑制T細胞、NK細胞以及單核-巨噬細胞的活性，是反映機體免疫狀態及預后的靈敏指標[12]。正常情況下，機體的腸腔內含有大量的細菌和ET，由于腸黏膜屏障的存在，導致ET難以入血，但是當SIRS發生時全身血流量重新分布，導致內臟血流量銳減，胃腸黏膜因發生缺血/缺氧代謝障礙而糜爛、壞死，出現腸黏膜屏障破壞，腸道內細菌移位、ET吸收入血，進而激活中性粒細胞，導致炎性因子大量釋放，進一步加劇了SIRS[13-14]。因此，監測血中內毒素水平可以判斷由早期腸屏障損傷導致的ET移位，了解腸黏膜屏障功能情況[15]。D-LA是細菌發酵的代謝產物，腸道內多種細菌均可產生D-LA，但在正常情況下很少被吸收，而且哺乳動物不產生D-LA，也不能或是僅能緩慢代謝D-LA，因此，當腸道受損時，腸黏膜的屏障遭到了破壞，腸的通透性增加，腸道細菌產生的D-LA也可以通過腸道進入到血液中，使得血液中的D-LA水平升高，因此，監測血液中D-LA的水平可以及時反映腸黏膜的損害程度和通透性的變化[9]。DAO主要存在于小腸黏膜上皮細胞內，在腸黏膜細胞出現壞死時，DAO可釋放入血，或隨壞死脫落的腸黏膜細胞進入到腸腔內，導致血液或腸腔內的DAO活性增高[15]，DAO在外周血中活性穩定，因此，測定DAO在外周血中的變化，可反映腸黏膜的狀態，血液中DAO含量升高反映了腸黏膜上皮細胞的損傷以及腸屏障結構的破壞[15]。而腸黏膜的組織形態學觀察是腸屏障功能評價最直接的依據，利用顯微鏡觀察腸黏膜，能夠比較準確分析腸黏膜上皮形態結構的變化[16]。

本研究表明，大鼠腹腔注射Zym后血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10升高，表明大鼠腹腔注射Zym后出現了炎癥反應，大鼠腹腔注射Zym后血清D-LA、DAO、ET水平升高，病理組織學檢查可見小腸黏膜明顯水腫，黏膜上皮細胞排列紊亂，黏膜上皮輕度脫落，固有層充血，杯狀細胞減少，炎癥細胞增多，表明大鼠腹腔注射Zym后腸屏障受損、腸黏膜通透性升高，提示造模成功，與文獻報道一致[17]。

腸道是應激狀態下機體內穩定和全身炎癥反應的重要調節者，腸道病變不僅促發SIRS失控，而且在SIRS進程中起著推波助瀾的作用，因此，針對腸道進行多角度、多途徑的保護治療，將有助于控制SIRS及MODS的發生。本研究表明，梔子苷可降低Zym所致腸黏膜屏障損傷大鼠血清致炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，增加抗炎因子IL-10水平，并可降低該模型大鼠血清ET、D-LA和DAO水平，減輕腸黏膜病理性損傷，說明梔子苷對Zym所致的大鼠炎癥反應及腸黏膜屏障損傷具有保護作用。本研究為梔子苷的臨床應用提供了實驗依據。

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