HER-2與VEGF-C在胃癌組織中的表達及其相關性研究

李敏 朱家勝

胃癌（GC）是全球最常見的消化道惡性腫瘤及癌癥相關死亡原因之一，其發病率、死亡率在惡性腫瘤中均排在前列。胃癌全球高發區主要集中在亞洲，而亞洲高發區又主要集中在日本及中國［1］。有統計數據顯示我國胃癌新發病例占全球胃癌發病的42.6%，盡管近年來有數據顯示胃癌死亡率呈現下降趨勢，但其總體死亡率相比于歐美等國仍處于較高水平［2］。腫瘤的生長離不開新生的脈管系統為其提供充足的營養物質并帶走代謝產物，目前研究比較多的分子標志物有血管內皮生長因子（VEGF）家族和人表皮生長因子（HER）/neu家族。VEGF-C和HER-2在腫瘤的擴散轉移過程中作用顯著［3］。本文探討HER-2與VEGF-C在胃癌組織中的表達情況及其與胃癌不同臨床病理特征之間的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月至5月皖南醫學院附屬弋磯山醫院胃腸外科61例擇期行開腹胃癌D2根治術患者手術標本。根據美國癌癥聯合會（AJCC）于2010年頒布的第七版分期（TNM分期），Ⅰ期19例，Ⅱ期16例，Ⅲ期26例；女11例，男50例，年齡41～89歲。按年齡分為2組（≥60歲43例，＜60歲18例）；賁門及胃底18例，胃體20例，胃竇及幽門23例。

1.2 主要儀器及試劑 Pathcentre全自動密封式脫水、BMJ-Ⅲ型包埋機、電熱恒溫鼓風干燥機、LeicARM2135切片機、WD900B格蘭仕微波爐、科龍BCD-272/HC電冰箱、即用型SP試劑盒、HER-2單抗體、VEGF-C單抗體、美國BioGenex全自動免疫組化機、Olympus BX 40光學顯微鏡、DAB底物顯色劑、磷酸鹽緩沖液 PBS（0.01M，pH7.4）、單道可調式移液器、移液器吸嘴、實驗沖洗瓶、孵育盒、耐高溫塑料染色架。

1.2 方法 （1）切片及光學顯微鏡診斷：①常規石蠟標本切片：使用LeicA-RM2135切片機，將所有石蠟包埋標本進行切片。切片厚度為5μm。每例標本制作2張切片。②上述每張標本均行常規HE染色，按胃癌組織學分類、分級標準（1981年WHO制定）進行光學顯微鏡診斷。（2）HER-2/neu的測定（同VEGF-C的測定）：運用免疫組織化學SP法測定HER-2/neu。具體操作方法：①脫蠟步驟：將組織片置入90℃溫箱中烘片20min后；經二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ分別5min脫蠟；無水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ中梯度脫水1min；再取出并緩慢流水沖洗1min。②酶的封閉與抗原修復：用高壓鍋預熱pH8.0的EDTA抗原修復液至沸騰，放入切片，閉緊蓋子，大火加熱至噴氣開始計時2.5min；關閉火源靜置15min后流水沖洗壓力鍋10min冷卻至室溫；再經3% H2O2過氧化氫孵育10min后移入PBS液中，套圈，PBS沖洗切片；PBS 沖洗4次，每5min/次。③免疫組化染色（機器操作部分）。④封片：取出切片，流水沖洗1min，無水乙醇1min，共3次；取出風干，中性樹膠封片；鏡下觀察，判斷結果。

1.4 觀察指標 （1）VEGF-C陽性細胞判定：由兩位病理科專家獨立觀察10個高倍鏡視野，棕黃色顆粒染色定位于腫瘤細胞胞質與胞膜染色。VEGF-C陽性結果根據染色程度和染色細胞百分率進行綜合評分判定：①未見染色為0分，染色淡為1分，染色適中為2分，染色深為3分；②染色細胞數占所觀察視野細胞數≤5%計為0分，6%～25%計為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分。最終得分計算方法為：平均著色程度得分乘以平均著色細胞所占百分率。0～1分為陰性（-），2～3分為（+），4～6分為（++），＞6分為（+++）。（+）表示弱陽性結果，（+++）表示強陽性結果。結果＞（++）判斷為VEGF-C陽性。（2）HER-2陽性細胞判定：由兩位主治以上職稱的病理科醫師獨立觀察10個高倍鏡視野，棕黃色顆粒染色定位于細胞膜上。HER-2陽性結果判定：①“0”（陰性）指細胞膜均無染色或≤10%腫瘤細胞膜染色；②“+”（陰性）指染色腫瘤細胞＞10%，細胞膜不完整，弱染色；③“++”（不確定）指：染色腫瘤細胞＞10%，細胞基底膜和側膜輕度至中度完整染色；④“+++”（陽性）指：染色腫瘤細胞＞10%，細胞膜基底膜和側膜完整，強染色。

1.5 統計學分析 采用SPSS 19統計軟件。計數資料用χ2檢驗和Fisher檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HER-2陽性檢出率與VEGF-C陽性檢出率的比較 VEGF-C陽性表達與HER-2陽性表達無明顯相關性（P＞0.05）。見表1。

表1 HER-2陽性檢出率與VEGF-C陽性檢出率的比較

2.2 胃癌組織中HER-2、VEGF-C與患者各臨床特征的關系 見表2。

表2 胃癌組織中HER-2、VEGF-C與患者各臨床特征的關系

3 討論

胃癌在全球范圍內無論是發病率還是死亡率均排在惡性腫瘤前列，是人類健康的重大威脅之一［4］。由于缺乏較完善的早期胃癌篩查指南，我國胃癌早期診斷率較低，多數胃癌確診時已處于進展期，并發生不同程度的轉移。胃癌治療方式主要以手術聯合放化療的綜合治療為主。

VEGF在胃癌組織中其表達率與各臨床特征之間的關系報道不盡相同。胃癌組織中VEGF陽性表達率約39.0%～59.4%［5］。本資料中，VEGF-C的陽性表達率為49.9%，與Xie LX等［6］用IHC法的結果報道較為接近。VEGF-C在有淋巴結轉移的胃癌組織中表達顯著增高。但并不是所有的VEGF-C表達陽性的病例均發生淋巴結的轉移，相反也并不是所有發生淋巴結轉移的病例VEGF-C陽性表達。作者認為導致該結果的可能性一種是促進淋巴結轉移的途徑較多，VEGF-C并不是唯一一種促淋巴管生成因子；另一種可能是VEGF-C陽性表達在淋巴結轉移方面無明顯促進作用或作用微弱。本資料結果表明，淋巴結轉移組胃癌組織中VEGF-C表達顯著增高與VEGF-C促進淋巴管生成作用有關，VEGF-C促進了淋巴管的形成，從而促進胃癌的轉移，但其卻不是唯一一種促進淋巴管生成的因子。VEGF-C的高表達在臨床工作中對胃癌轉移有預測作用，而且在胃癌的治療、預后的判斷及監測上幫助頗大。

Weiling He等［7］和Weiguo Cao等［8］的研究綜合臨床病理資料及隨訪研究發現，胃癌標本中VEGF-C表達明顯增高者常預示胃癌病期晚、預后差、生存期短。本資料中Ⅱ期與Ⅲ期之間的結論與Weiling He等和Weiguo Cao等相符，其他各期之間需要進一步增大樣本量研究才可得出結論。

HER家族在促進腫瘤細胞增殖、促進腫瘤進展與轉移等方面作用顯著。各研究報道中免疫組化法檢測胃癌組織中HER-2陽性表達率在6.8%～34.0%［9］。較多報道稱HER-2表達陽性率與胃癌分型（Lauren分型）有顯著相關性。美國臨床腫瘤學會（ASCO）于2014年公布的中國胃癌患者HER-2表達與病理分型關系顯示，HER-2表達陰性患者生存期最好，而彌漫型生存期最差。關于腫瘤位置與HER-2陽性率的關系各方報道尚存在爭議，大部分學者報道其與位置無相關性［10］。

本資料，HER-2陽性表達率為11.5%，與其他大部分研究報道相比陽性率偏低。分析其原因可能為：本實驗中選取病例61例，樣本量有限；實驗過程中某些操作可能導致結果出現偏差；檢測技術的誤差，IHC檢測結果靈敏度不夠。HER-2陽性表達率與上述臨床病理特征之間無明顯相關性，與大部分研究報道比較相符。關于其表達率與Lauren分型之間、及與預后的關系缺乏進一步跟進、隨訪資料，未能在該處得出結論。

胃癌的靶向治療已然成為當前胃癌治療的熱點。HER-2與VEGF-C在胃癌組織中過表達對胃癌的靶向治療提供理論依據。有報道稱HER-2的過度表達通過一些特殊機制上調VEGF的表達水平，并且在HER-2過表達胃癌患者的治療中聯合抗HER-2和抗VEGF效果明顯好于單純抗HER-2治療［11］。假設兩者間確實存在必然聯系，將給胃癌的治療帶來更加有效的方法。本資料中未發現VEGF-C與HER-2之間的相關性，考慮可能與樣本量小有關，如繼續探究兩者之間的關系必須增大樣本含量，收集更多跟進隨訪資料。