吉非貝齊對心肌纖維化的作用及機制研究①

周凱章 鄭理玲 汪鐵軍

(湖北省腫瘤醫院，武漢430079)

心肌纖維化是細胞外基質在心肌間質內過度沉積，能夠導致心臟收縮和舒張功能障礙，同時也是多種心血管疾病發展為心力衰竭的共有病理過程[1]。目前的研究顯示他汀類藥物具有降脂、抗炎、減輕心肌肥厚以及調節內皮細胞功能的作用[2]。本研究采用壓力負荷誘導小鼠構建心肌纖維化模型，探討吉非貝齊是否能夠抑制慢性壓力負荷誘導的心肌纖維化，進一步探討吉非貝齊在心肌纖維化中的機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 8周齡C57BL/6雄性小鼠60只[北京華孚康生物科技實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(京)2017-0012]。小鼠適應環境1周選取體重滿足23.5～27.5g的雄性小鼠，TAC術構建心肌纖維化模型。

1.1.2藥物與試劑 一抗T-AKT (4691，1∶1 000)、phospho-AKT (P-AKT，4060，1∶1 000)、T-glycogen synthase kinase 3β (GSK3β，9315，1∶1 000)、P-GSK3β (9323P，1∶1 000)、T-P38 (9212P，1∶1 000)、P-P38 (4511P，1∶1 000)、T-ERK (4695，1∶1 000)、P-ERK (4370P，1∶1 000)均購于Cell Signaling Technology公司;熒光二抗IRDye?800CW購自LI-COR公司;α-SMA抗體購于博士德生物公司;天狼星紅(PSR)染色試劑盒由北京海德創業公司提供。

1.1.3儀器 170-3940半干轉印系統(美國Bio-Rad公司);ODY-2182雙通道熒光掃描儀(美國LI-COR公司)；CX22光學顯微鏡(日本Olympus公司)；LightCycler480熒光定量PCR儀(德國Roche公司)；VFA-23-BV小動物呼吸機(美國Kent Scientific公司)；Mylab30超聲儀(意大利Esaote公司)。

1.2方法

1.2.1模型建立 根據既往研究構建心肌纖維化模型[3]。具體步驟如下：麻醉后備皮，固定小鼠，碘伏和75%酒精消毒手術區域，沿第二、三肋間隙剪開皮膚后顯露胸腔，分離胸主動脈，其上方平行放置26G或27G去尖針頭，用7號手術絲線將針頭和主動脈弓一齊扎緊后將針頭移去，關胸后縫皮。假手術在分離出胸主動脈后只掛線不結扎，其余步驟同TAC組。術后四周行心臟超聲檢查，取材。

1.2.2分組和給藥方法 60只小鼠隨機分為4組(每組15只)：假手術+生理鹽水組、假手術+吉非貝齊組、TAC+生理鹽水組、TAC+吉非貝齊組。假手術+吉非貝齊組和TAC+吉非貝齊組小鼠在術前7 d給予吉非貝齊(20 mg/kg)，均溶于1 ml 生理鹽水中制成懸液，采用灌胃給藥；假手術+吉非貝齊組和TAC+生理鹽水組小鼠給予同等劑量生理鹽水灌胃。然后，根據分組情況按上述方法構建心肌纖維化模型。給藥持續至術后4周。

1.2.3超聲心動圖檢查TAC 術后4周用小動物超聲儀進行小鼠心臟超聲檢查，使用異氟烷麻醉小鼠，超聲探頭在心尖處調整方向和位置，直到可以獲得清晰的胸骨旁左室乳頭肌短軸切面，進入M型超聲模式，測量并記錄舒張末期左室內徑(LVEDd)、收縮末期左室內徑(LVESd)、短軸縮短率(FS)。

1.2.4心肌組織學分析 術后4周處死小鼠，取心肌組織放置于中性福爾馬林中固定48 h，酒精梯度脫水后石蠟包埋，進行PSR染色及免疫組化染色，拍照后用 Image-Pro Plus5.0 軟件測定左心室膠原分數。

1.2.5免疫蛋白印跡(Western blot)法檢測AKT、GASK3β、ERK、P38總蛋白及相應磷酸化的表達水平 提取心室心肌組織后，行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，以75 mV恒壓電泳，待溴酚藍指示劑跑出濃縮膠后加壓至100 mV。停止電泳；于4℃環境下轉膜，轉膜電流0.2 A，轉膜時間為90 min；將轉膜后的PVDF膜放入封閉液中封閉 1 h；洗膜緩沖液(Tris buffered saline tween，TBST)洗膜 5 min，連續3次，一抗4℃孵育過夜；TBST洗膜5 min，連續3次，二抗室溫孵育1 h；TBST洗膜5 min，連續3次，Licor Odyssey 雙色紅外成像系統進行掃膜和圖像分析，分析蛋白亮度值，目的蛋白的亮度值與內參GAPDH亮度值的比值為目的蛋白的表達量。

1.2.6免疫組化染色 選用肌成纖維細胞標志物α-SMA檢測纖維化水平。3%雙氧水抑制內生過氧化物酶活性，8%羊血清封閉。一抗4℃過夜孵育。PBS清洗，加入二抗37℃孵育30 min。PBS清洗，DAB顯色后拍照，用 Image-Pro Plus5.0 軟件測定光密度。

1.2.7PCR檢測 按Trizol說明書提取組織總RNA，依據TaKaRa公司的逆轉錄試劑盒說明逆轉錄成cDNA。逆轉錄為20 μl反應體系：RNA樣本2 μg，random primer 2 μl，dT primer 1 μl，補充H2O (RNase-free) 至終體積20 μl。用瞬時離心機將管中液體離心至底部后放入PCR儀中，以70℃反應10 min，迅速取出樣本插入冰中終止反應；按照反應條件，在EP管中加入RT-buffer、Rtase、inhibitor、dNTP；混勻后用瞬時離心機將管中液體離心至底部后放入PCR儀中，以25℃ 10 min、50℃ 60 min、90℃ 5 min、4℃ 5 min的程序進行反應。完成后加除酶水至80 μl，于-80℃保存。PCR反應為20 μl反應體系：PCR等級的水8 μl,SYBR Green Ⅰ Master 10 μl,上游引物0.5 μl,下游引物0.5 μl,cDNA模板 1 μl,總體積20 μl，上述試劑混勻后點入PCR儀器配套的96孔板中，每個樣品設置3個復孔，以1 500 g 離心3 min，置于PCR儀器上檢測，引物序列見表1。

2 結果

2.1超聲心動圖檢測結果 與假手術組相比，TAC組小鼠LVEDd、LVESd、Fs在TAC術后均明顯改變(P<0.01)，表明TAC術構建心肌纖維化模型成功。與TAC+生理鹽水組比較，TAC+吉非貝齊組LVEDd、LVESd均顯著降低，Fs降低程度顯著緩解(P<0.01，圖 1、表 2)。

2.2取材結果 4組小鼠的心肌重構程度比較(圖2)：與假手術組相比，TAC組的心重比體重(HW/BW)、心重比脛骨長(HW/TL)比值均升高(P<0.01)，說明TAC手術成功誘導小鼠心肌肥大。TAC+吉非貝齊組HW/BW、HW/TL與TAC+生理鹽水組相比無統計學差異(P>0.05)。

2.3PSR染色結果 TAC組中左室膠原分數明顯高于假手術組，肌纖維排列疏松紊亂，心肌間質內有大量膠原纖維生成(P<0.01)。TAC+吉非貝齊組與TAC+生理鹽水組相比，其心肌間質纖維化程度明顯改善，圖3為術后4周PSR染色，選自每組小鼠心臟切片中隨機抽樣圖片。免疫組化結果顯示：與假手術組相比，肌成纖維細胞標志物α-SMA(圖3)在TAC組中表達明顯增加(P<0.01)，而給予吉非貝齊干預后α-SMA表達增高水平明顯緩解。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequences

GenePrimer sequencesGAPDHSense 5′-ACTCCACTCACGGCAAATTC-3′Antisense 5′-TCTCCATGGTGGTGAAGACA-3′IL-6Sense 5′-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3′Antisense 5′-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3′TNF-αSense 5′-TGCCTCAGCCTCTTCTCATT-3′Antisense 5′-GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3′Collagen ⅠSense 5′-TGGTACATCAGCCCGAAC-3′Antisense 5′-GTCAGCTGGATAGCGACA-3′Collagen ⅢSense 5′-GTCAGCTGGATAGCGACA-3′Antisense 5′-GAAGCACAGGAGCAGGTGTAGA-3′CTGFSense 5′-TGTGTGATGAGCCCAAGGAC-3′Antisense 5′-AGTTGGCTCGCATCATAGTTG-3′

2.4RT-PCR檢測結果 與假手術組相比，TAC組IL-6、TNF-α、CollagenⅠ、CollagenⅢ以及CTGF轉錄水平明顯增高(圖4，P<0.01)；而TAC+吉非貝齊組與TAC+生理鹽水組相比，IL-6、TNF-α、CollagenⅠ、CollagenⅢ以及CTGF轉錄增高水平明顯得到緩解(P<0.05)。

圖1 4組小鼠心臟超聲心動圖Fig.1 Four groups of mice with echocardiography

GroupsNumberLVEDd (mm)LVESd (mm)FS(%)Sham+saline154.04±0.122.33±0.0942.4±1.3Sham+gemfibrozil154.01±0.162.31±0.1142.4±1.35TAC+saline154.56±0.21)3.07±0.171)32.73±1.871)TAC+gemfibrozil154.09±0.152)2.44±0.102)40.27±1.492)

Note：Compared with the sham+saline group，1)P<0.05;compared with the TAC+saline group，2)P<0.05.

圖2 4組小鼠心重比體重、心重比脛骨長比值比較Fig.2 Comparison of HW/BW,HW/TL in four groupsNote: Compared with the sham+saline group，*.P<0.05.

圖3 天狼星紅和免疫組化染色觀察術后4周小鼠心肌組織的變化Fig.3 Sirius red and immunohistochemically staining for myocardial tissue changes in mice 4 weeks after TACNote: Compared with the sham+saline group，*.P<0.05;compared with the TAC+saline group，#.P<0.05.

圖4 PCR檢測小鼠心肌組織mRNA表達水平Fig.4 Detection of mRNA expression levels in myocardial tissue of mice by PCRNote: Compared with the sham+saline group，*.P<0.05;compared with the TAC+saline group，#.P<0.05.

2.5Western blot測定小鼠心肌組織AKT、GASK3β、ERK、P38總蛋白及相應磷酸化的表達水平 與假手術組相比，TAC組AKT、GASK3β、ERK、P38磷酸化水平均明顯增高(P<0.01)；而TAC+吉非貝齊組與TAC+生理鹽水組相比，AKT、GASK3β磷酸化水平均顯著降低(P<0.01)，而ERK、P38磷酸化水平無統計學差異(P>0.05)。見圖5。

圖5 吉非貝齊對AKT和MAPK信號通路的影響Fig.5 Effect of gemfibrozil on AKT and MAPK signal-ing pathwaysNote: Compared with the sham+saline group，*.P<0.05;compared with the TAC+saline group，#.P<0.05.

3 討論

心肌纖維化是各種心血管疾病共有的病理過程，是機體為應對血流動力學負荷增加的適應性反應，其特征是成纖維細胞激活和細胞外基質積累，最終導致充血性心力衰竭和猝死[4]。心肌纖維化能夠干擾心肌細胞的電傳導以及減少心臟毛細血管密度[5]。本實驗旨在觀察吉非貝齊對壓力超負荷所致小鼠心肌間質纖維化，探討吉非貝齊對心肌纖維化的影響及可能機制，為臨床治療提供理論依據。

各種病理性刺激(如高血壓、主動脈瓣狹窄)引起壓力負荷增加能夠引起心肌細胞肥大和心肌間質纖維化，表現為心重增加以及心室壁增厚[6]。小鼠胸主動脈縮窄術能夠模擬壓力負荷誘導的心肌重構過程。本研究通過TAC術構建心肌纖維化模型，術后4周超聲心動圖結果顯示左心室壁厚度增加，短軸縮短降低。同時，取材結果顯示HW/BW、HW/TL顯著增加。PSR染色顯示心肌間質膠原增多，纖維化程度加重。提示TAC術構建心肌纖維化模型成功。

吉非貝齊除了有調脂的作用外還具有抑炎癥反應及改善血管內皮功能的作用[7]。本研究結果表明，雖然吉非貝齊并不能降低HW/BW、HW/TL的比值，減輕壓力負荷誘導的小鼠心肌肥厚，但是免疫組化染色以及PSR染色結果提示吉非貝齊能夠顯著抑制壓力負荷誘導的心肌纖維化。心肌纖維化能導致心肌僵硬程度增加，心肌舒張功能減退，心臟順應性降低，而吉非貝齊能夠有效抑制心肌纖維化，從而增加心臟順應性。因此，該結果進一步解釋了吉非貝齊能夠減輕壓力負荷誘導的短軸縮短率的下降。

有研究表明心肌纖維化的過程伴隨大量炎癥介質的活化，如TNF-α和IL-6等[8]。Chou等[9]發現IL-6與心肌纖維化密切相關，醛固酮能夠激活AKT信號通路介導IL-6的分泌，從而誘導纖維化相關基因，如：CollagenⅠ以及CollagenⅢ高表達，促進心肌纖維化的發生發展。此外，Zhang等[10]發現心肌過表達TNF能夠導致心肌持續性的炎癥反應，促進心肌纖維化進展。同時來自擴張型心肌病患者的心肌活組織檢查顯示嚴重的心肌間質纖維化伴隨了大量淋巴細胞和巨噬細胞的浸潤[11]。炎癥不僅引起心肌纖維化，而且改變了心臟中膠原異構體的比例[12]。本研究中TAC組的心肌中TNF-α和IL-6轉錄水平升高，說明壓力負荷導致心肌炎癥反應加重，TAC+吉非貝齊組TNF-α和IL-6轉錄水平較TAC+生理鹽水組明顯降低，說明吉非貝齊通過抑制炎癥發揮了心臟保護作用。

多條信號參與了心肌纖維化過程，其中AKT/GSK3β途徑在病理性心肌纖維化中發揮了重要作用。轉化生長因子-β (TGF-β) 能夠通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)增加AKT的磷酸化[13]。抑制AKT激活能夠顯著抑制壓力負荷誘導的心肌纖維化[14]。激活的AKT直接磷酸化GSK3β導致其失活。有研究表明特異性成纖維細胞敲除Gsk3β能夠增加心肌梗死后的瘢痕和纖維化的形成[15]。而我們的研究發現吉非貝齊能夠減少AKT和GSK3β的磷酸化，從而減輕壓力負荷誘導的心肌纖維化。

既往研究顯示，吉非貝齊能夠通過抗氧化作用減輕腹主動脈縮窄誘導的肥胖大鼠心肌重構過程[16]。然而，吉非貝齊對壓力負荷誘導的非肥胖小鼠心肌纖維化是否有保護功能尚無相關研究佐證。與以上研究結果一致，我們在心肌纖維化模型中觀察到吉非貝齊治療能夠顯著減輕心肌纖維化，保護心臟功能。我們進一步發現，吉非貝齊治療能夠減輕炎癥反應、調控AKT信號通路，但對心肌肥厚的影響不明顯。以上差異可能是由于兩者模型不一致，前者使用肥胖大鼠作為實驗對象，而高脂飲食誘導的肥胖就能導致心肌肥厚和心肌間質纖維化。因此，吉非貝齊的降脂以及抗氧化作用在腹主動脈縮窄誘導的肥胖大鼠心肌重構中發揮了重要作用。本研究進一步拓展了吉非貝齊的藥理學功效，為臨床防治心肌纖維化提供了理論依據和有效的策略。

綜上所述，吉非貝齊能通過抑制TNF-α和IL-6炎性細胞因子的轉錄而發揮抗炎作用，并通過抑制AKT/GSK3β信號通路從而達到抑制心肌纖維化，改善心腔擴大和心功能的作用，這一作用可能是吉非貝齊抑制心肌纖維化，改善心功能的機制之一，為臨床防治心肌纖維化提供新的思路。