基于TCGA數據庫分析甲基化促進精原細胞瘤進程的作用機制

陳賽鵬，王嘉南，王 林，彭華紅，肖龍飛，楊 闊

（天津醫科大學第二醫院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津300211）

睪丸生殖細胞瘤（Testieular Germ Cell Tumor，TGCTs）占睪丸原發性惡性腫瘤的90%以上，是15～35歲男性最常見的實體瘤[1]。臨床上將TGCT分為精原細胞瘤和非精原細胞瘤兩大類，后者可細分為胚胎細胞癌、絨毛膜癌、卵黃囊瘤和畸胎瘤[2]。American Joint Committee on Cancer(AJCC)根據精原細胞瘤的增殖和轉移的程度分為精原細胞瘤Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期。Ⅰ期精原細胞瘤術后通過密切隨訪,藥物輔助化療和輔助放療可以完全治愈[3]。然而,Ⅱ期、Ⅲ期的術后的存活率較低,術后一般以放療和化療為主[4]。目前精原細胞瘤的組學研究進展尚不完善，因此,探索精原細胞瘤的基因表達譜對了解原始生殖細胞與腫瘤形成的關系是非常重要的。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，它可以在不改變DNA序列的情況下改變基因組的表達。DNA甲基化的主要機制是將甲基(CH3)與CG二核苷酸的細胞因子結合，從而改變染色質結構、DNA構象、DNA穩定性，以及誘導DNA與蛋白質相互作用以控制基因表達的方式[5]。許多研究表明，DNA甲基化在腫瘤的發生發展過程中起著至關重要的作用，主要表現為DNA甲基化模式和DNA甲基轉移酶表達水平的改變[6]。然而，到目前為止還沒有系統的分析甲基化在精原細胞瘤進展中的作用。TCGA(The Cancer Genome Atlas)中有156例精原細胞瘤的450K甲基化數據和156例精原細胞瘤的RNA seq數據。因此筆者將TCGA甲基化芯片數據與RNA seq數據進行整合，分析甲基化調控的基因表達在精原細胞瘤惡性進展過程中發揮作用。

1 資料與方法

1.1 差異基因的篩選 從TCGA數據庫中下載106例精原細胞瘤Ⅱ期、Ⅲ期和26例Ⅰ期樣本的轉錄組測序數據，使用GDCRNAtools R軟件包進行差異基因分析，并取fold change為2，FDR為0.05作為篩選閾值，并將篩選的差異基因進行KEGG信號通路分析。

1.2 甲基化差異位點的篩選 在分析甲基化數據時，使用ELMER R軟件包來進行甲基化差異位點分析。ELMER R包參數設定

createMAE函數：linearize.exP=TRUE

get.diff.meth函數：minSubgroupFrac=1,sig.dif=0.2,cores=1，pvalue=0.05,mode="supervised"

GetNearGenes函數：numFlankingGenes=20

get.pair函數：minSubgroupFrac=1,raw.pvalue=0.05,filter.probe=FALSE,cores=1,mode="supervised",Pe=0.05

enriched.motif.hyper函 數 ：min.incidence=10,lower.OR=1.1

其他參數保持默認。對TCGA數據庫中的156例精原細胞瘤標本的450K甲基化數據進行差異表達分析，每個芯片有485 577個甲基化檢測位點，獲取Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅰ期的差異甲基化位點，然后將關聯差異甲基化位點的前后20個基因作為可能受甲基化調控的基因。

1.3 差異甲基化位點的差異基因配對分析 將獲得差異甲基化位點的關聯基因與Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅰ期的差異基因取交集，找出差異甲基化位點周圍有顯著表達差異的基因，并將基因表達量與甲基化位點的甲基化水平進行相關性分析。

1.4 差異基因的生存曲線分析 將差異甲基化位點-差異基因配對進行生存分析，尋找顯著影響精原細胞瘤患者的生存情況的受甲基化調節的差異基因。

2 結果

2.1 通過差異基因分析，筆者找到了864個差異基因，其中上調基因有410個，下調基因有456個，差異表達火山圖如圖1A所示，差異基因類型的分布如圖1B所示。

圖1 精原細胞瘤差異基因的篩選及分類Fig 1 Screening and classification of differential genes in seminoma

2.2 將甲基化數據進行差異甲基化位點的分析，顯示Ⅱ期、Ⅲ期精原細胞瘤的平均甲基化水平高于Ⅰ期，如圖2。筆者對Ⅱ期、Ⅲ期精原細胞瘤與Ⅰ期精原細胞瘤之間的差異甲基化位點進行了分析，顯示162個在Ⅱ期、Ⅲ期精原細胞瘤中甲基化水平升高的位點。

圖2 Ⅱ期Ⅲ期和Ⅰ期的差異甲基化水平分析Fig 2 Analysisofdifferential methylation levels ofstageⅡ & Ⅲ and stageⅠ

2.3 將篩選出來的差異甲基化位點與前后最近的20個基因進行關聯，并且將這些基因與差異表達基因取交集，找出表達水平受甲基化調節的基因，得到22個差異甲基化位點-差異表達基因配對。對配對的甲基化水平和基因表達水平進行了Pearson相關分析，最終得到了差異基因的表達與甲基化水平存在負相關的基因KCNC1，具有較強的相關性，結果如圖3。

圖3 高甲基化與KCNC1表達的關系分析Fig 3 Analysis of the relationship between hypermethylation and the expression of KCNC1

2.4 GEPIA在線工具（http://gepia.cancer-pku.cn）對22個差異甲基化位點-差異表達基因配對的基因進行了生存分析，發現KCNC1對精原細胞瘤患者的生存期有顯著影響，高甲基化與KCNC1的低表達相關，并且KCNC1的低表達與更差的預后有關。筆者比較了KCNC1在精原細胞瘤和正常睪丸組織之間的差異，結果顯示精原細胞瘤中的KCNC1表達量較低，在正常睪丸組織以及Ⅰ期和Ⅱ期、Ⅲ期精原細胞瘤中的表達呈遞減趨勢，如圖4。

圖4 KCNC1在所有腫瘤和正常組織中的表達及在精原細胞瘤中的無進展生存期分析Fig 4 Expressions of KCNC1 in all tumors and normal tissues and disease-free survival in seminoma

3 討論

目前，對于精原細胞瘤的實驗研究進展不是很完善，最近的全基因組關聯研究 (GWAS)發現KITLG、SPRY4、T1、TERT、ATF7IP 與睪丸生殖細胞瘤的易感性相關[7-12]。對于精原細胞瘤的基因組學的研究也在逐漸開展。

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，在腫瘤的發生發展過程中起著至關重要的作用，然而不同基因中腫瘤特異性甲基化的改變被證明具有不同的生物學效應。一些研究表明，低甲基化通過激活不同腫瘤中的致癌基因而促進腫瘤的發生[13]。也有證據表明，高甲基化可以抑制腫瘤抑癌基因的表達，從而促進腫瘤的進展。例如,在視網膜母細胞瘤中高甲基化可以使腫瘤抑制基因Rb的表達相比無甲基化減少到 8%[6，13]。

本文通過生物信息學技術，分析篩選了TCGA上傳的精原細胞瘤患者的轉錄組測序數據，確定了22個差異基因在Ⅱ期Ⅲ期精原細胞瘤中表達隨著甲基化的程度降低，因此考慮高甲基化在精原細胞瘤中通過抑制了這些基因的表達，進而促進了精原細胞瘤的進展。通過分析差異基因的生存曲線，發現高甲基化導致基因KCNC1低表達的精原細胞瘤患者生存期短，有統計學差異。隨著精準醫療的推廣，精原細胞瘤的治療不僅僅局限于手術治療，通過基因的靶向藥物治療，可以抑制精原細胞瘤的進展，從而改善患者的預后。

KCNC1這個基因編碼了一個完整膜蛋白家族，該家族可介導興奮膜的電壓依賴性鉀離子滲透性[14]。K+通道是質膜中種類最豐富的離子通道，廣泛分布于包括癌細胞在內的各種細胞中。能與生化信號級聯進行串擾，通過調節細胞內K濃度、產生膜電位、介導細胞體積變化、參與Ca信號傳遞、與膜受體和下游效應子在分子復合物內直接相互作用等方式，幾乎調控所有細胞過程。在腫瘤細胞表現出K通道的異常表達和活性模式通常通過影響Ca激活的IK或者BK通道，進而驅動腫瘤細胞的腫瘤轉化、惡性進展、轉移或耐藥[15-16]。也有研究表明，K+通道在乳腺癌中影響腫瘤細胞增殖和細胞周期進展[17]。K+通道在精原細胞瘤中缺乏研究，在精原細胞瘤中發揮的作用也不清楚，本文通過篩選得到KCNC1基因，高甲基化會降低KCNC1的表達并且促進了精原細胞瘤的進展。已有的研究表明KCNC1能介導興奮膜的電壓依賴性鉀離子滲透性，促進K+通道的激活，抑制精原細胞瘤的進展。