千佛菌含藥血清對H22小鼠肝癌細胞增殖、凋亡的影響

胥冰 張麗君 郭小蘭 石小玲

【摘要】目的 觀察不同劑量千佛菌含藥血清對H22小鼠肝癌細胞增殖、凋亡的影響。探討其抑瘤作用機制。方法 制備H22小鼠肝癌細胞分別與大鼠空白血清及含不同劑量千佛菌的藥物血清在體外共同培養。四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測H22肝癌細胞增殖情況；流式細胞技術檢測H22肝癌細胞凋亡率。結果 與模型組比較，千佛菌大、小劑量含藥血清在作用24 h、48 h、72 h后均能抑制H22肝癌細胞增殖，差異有統計學意義（P<0.05），抑制率以大劑量、48h最高（P<0.01）；流式細胞技術檢測，大、小劑量含藥血清均可誘導凋亡，大劑量作用48h，凋亡率較高，與模型組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 千佛菌含藥血清能抑制H22小鼠肝癌細胞的生長，其作用機制可能與其抑制H22細胞增殖，誘導細胞凋亡有關。

【關鍵詞】千佛菌含藥血清；細胞增殖；細胞凋亡

【中圖分類號】R-5 【文獻標識碼】B 【文章編號】ISSN.2095.6681.2018.27..02

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑

藥材為陜西鎮安縣千佛菌種植基地千佛菌；四甲基偶氮唑藍（MTT，Sigma）；二甲基亞楓（DMSO，Sigma）；RPMI1640培養液（Hyclone）；胎牛血清。

1.2 主要儀器

5%CO2培養箱（BindCD-150），超凈工作臺（蘇州安泰），倒置熒光數碼顯微鏡NikonTS-100F（DS-5MC），精密電子天平（德國賽多利斯股份公司），流式細胞儀（BD，美國），二氧化碳恒溫細胞培養箱（BINDER C150）。

1.3 實驗動物、瘤株

SD大鼠20只，體質量（250±5）g，購自西安交通大學實驗動物中心，合格證號：SCXK（陜）2007-001。小鼠H22肝癌細胞株，我校免疫室贈予。

2 實驗方法

2.1 含藥血清的制備及滅活

大鼠適應性喂養一周后隨機分為4組（n=4）：空白組；模型組；含藥血清大、小劑量組。含藥血清組，取500 g千佛菌加水大火煮沸轉文火煎煮120 min，此法煎煮2次，合并兩次濾液并濃縮至0.5 L相當于1 g/mL生藥量為原液，以原液為大劑量即100%濃度；生理鹽水倍比稀釋后為小劑量即50%濃度2.5 g/（kg·次）灌胃給藥，2次/d。空白組，給予同劑量生理鹽水[3]。連續7 d，末次灌胃2 h后，麻醉，采血，無菌分離血清，56℃，30 min滅活處理，用

0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，置-20℃冰箱保存備用。

2.2 MTT法檢測千佛菌含藥血清對H22細胞增殖的影響

從液氮中取出H22細胞株復蘇。用含10% FBS 的1640培養基在37℃含5%CO2的孵箱中培養，至對數生長期，將其制備成密度為3×106/mL細胞懸液，接種于96孔培養板中，每孔100 μL?？瞻捉M加入1640培養液，含藥血清大劑量組加入100 μL100%含藥血清；含藥血清小劑量組：加入100 μL100%含藥血清，對照組：加入100 μL正常大鼠血清。每組設3個平行孔，培養24 h、48 h、72h后，每孔加入

5 mg/mL的MTT10 μL，培養箱中繼續培養4 h后，棄掉上清，每孔加入150 ul DMSO，振蕩10 min，待結晶充分溶解，酶標儀490 nm處測定吸光度（A），計算抑制率。生長抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

2.3 流式細胞儀檢測H22細胞凋亡

據MTT實驗結果最終選定各組在48 h為最佳作用時間，將培養24 h的H22細胞，取兩瓶，分別加入大小劑量含藥血清，作用48 h，收集各組細胞，PBS洗滌2次，75%冰乙醇固定，避光加入碘化丙啶（PI）染液混勻30 min，流式細胞儀檢測，計數10000個細胞，檢測凋亡率，實驗重復3次，取均值。

2.5 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件對數據進行處理，計量資料以“x±s”表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 千佛菌含藥血清對小鼠H22肝癌細胞增殖的影響

大、小劑量千佛菌含藥血清均對H22肝癌細胞的增殖有抑制作用 ，但大劑量更為明顯。抑制率呈明顯的時間-劑量依賴性，充分說明千佛菌能夠抑制腫瘤的增殖。

3.2 流式細胞儀檢測小鼠H22肝癌細胞凋亡

將不同劑量千佛菌含藥血清加入H22肝癌細胞培養48 h后，經流式細胞儀檢測，千佛菌含藥血清大、小劑量均能誘導H22肝癌細胞凋亡，而以大劑量組作用更顯著。與模型組相比，差異有統計學意義（P<0.01，P<0.05）。

4 討 論

千佛菌是一種藥、食兼用的珍稀食用真菌。主要含多糖、維生素、蛋白質以及微量元素等，其主要活性成分及抗腫瘤成分為灰樹花多糖，千佛菌具有“扶正固本”之功效。為祖國醫學之扶正固本藥，能增強機體的免疫力，改善癥狀，延長生存期，提高生活質量。本次實驗，我們通過制備千佛菌大鼠含藥血清，體外干預小鼠H22肝癌細胞24、48、72h發現均對H22肝癌細胞有一定的抑制增殖作用，且大劑量藥效最好。

綜上所述，本研究通過體外實驗，驗證了千佛菌含藥血清對小鼠H22肝癌細胞增殖、凋亡的影響，證實了千佛菌對H22細胞有較好的抑制作用，為臨床篩選抗腫瘤藥物，尤其為開發天然的低毒或無毒藥物提供了理論及實驗依據，也為腫瘤疾病的臨床治療提供了新思路、新方法。

參考文獻

[1] 徐錦堂.中國藥用真菌學[M].北京：北京醫科大學、中國協和醫科大學聯合出版社，1997，第1版：707.

本文編輯：劉欣悅