辣椒堿對小鼠淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性的影響

王利明 李敬雙

摘要：為探討辣椒堿對小鼠脾淋巴細(xì)胞免疫功能的影響，試驗(yàn)采取MTT法檢測辣椒堿對淋巴細(xì)胞增殖的影響，并采取ELISA法檢測辣椒堿對淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的影響。結(jié)果在一定的濃度范圍內(nèi)，辣椒堿能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞因TNF-α、IL-6的分泌，呈雙向調(diào)節(jié)。表明辣椒堿可通過刺激淋巴細(xì)胞增殖和促進(jìn)分泌細(xì)胞因子分泌發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)活性。

關(guān)鍵詞：辣椒堿;淋巴細(xì)胞;細(xì)胞增殖;細(xì)胞因子

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

doi： 10.3969/j.issn.2096-3637.201 9.13.003

0 引言

辣椒堿（Capsaicin）又稱辣椒素，是辣椒中的主要呈辣物質(zhì);在自然界中主要存在于茄科植物辣椒及其變種的果實(shí)的胎座組織及果皮和籽中，是一種極其辛辣的香草酰胺類生物堿，純度特別高的辣椒堿呈白色片狀、針狀的結(jié)晶或粉末，其分子式為C18H227NO3[1]。有研究表明，辣椒堿具有抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、抑菌[4]、促進(jìn)脂肪代謝[5]、抗炎鎮(zhèn)痛[6]、調(diào)節(jié)胃腸道和心血管保護(hù)[7]等作用，已經(jīng)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛使用。另外，辣椒堿在食品行業(yè)，生物農(nóng)藥行業(yè)、飼料領(lǐng)域[8]、保健品和食品添加劑工業(yè)等也以得到廣泛應(yīng)用，在免疫方面的研究較少。

試驗(yàn)使用MTT法檢測辣椒堿對淋巴細(xì)胞增殖的影響，采用ELISA法檢測辣椒堿對淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的影響，探討辣椒堿的免疫調(diào)節(jié)活性，為辣椒堿在獸醫(yī)臨床及飼料添加劑行業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級健康Balb/e小鼠購自錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 試驗(yàn)藥物

辣椒堿購自成都曼斯特生物科技有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、臺(tái)盼藍(lán)和四甲基偶氮唑鹽（ MTT）購自美國GIBCO公司;PBS緩沖劑購自上海生物技術(shù)服務(wù)公司;新生牛血清購自四季青生物工程有限公司;IFN-γ和IL-6試劑盒購白武漢博士德公司;三羥甲基氨基甲烷（ tris）購自南通潤豐石油化工有限公司;DMSO購白Solarbio。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞制備

把健康的BALB/C小鼠進(jìn)行頸椎脫臼致死后，在無菌環(huán)境中剖開小鼠腹腔，摘除脾臟，將分離后的脾臟組織放于1個(gè)細(xì)胞篩中，將細(xì)胞篩放人裝有PBS溶液的培養(yǎng)皿中。取1個(gè)無菌注射器，對其進(jìn)行碾壓，然后收集細(xì)胞篩外的PBS.1400 r/min離心15 min，收集懸液，加入ACK LysisBuffer（紅細(xì)胞裂解液）放置5 min，1 400 r/min，離心15min，棄上清，重復(fù)2-3次。在5% CO2、37℃恒溫條件下，用含10%新生牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，收集懸浮細(xì)胞。隨后，用TrypanBlue染色鑒別，活細(xì)胞數(shù)要達(dá)到95%以上[9-10]。

1.2.2 淋巴細(xì)胞增殖檢測

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入所收集到的淋巴細(xì)胞懸液，每孔加入100?μL，并設(shè)置空白對照組，濃度分別為25、50、75和100μg/mL辣椒堿的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，分別加入100?μL、放于37℃、5%C02的恒溫箱中培養(yǎng)44h，再分別加入20 μL MTT液，混勻，4h后，以1 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，棄去上清液;每孔再分別加入150 μLDMSO液，檢測酶標(biāo)儀于570 nm處的OD值。運(yùn)用公式刺激指數(shù)一藥物孔OD值/對照孔OD值，以此計(jì)算淋巴細(xì)胞的增殖效率[11]。

1.2.3 淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ，和IL-6檢測

在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入收集到的淋巴細(xì)胞懸液，每孔1 mL，設(shè)置空白組、濃度分別為25、50、75和100μg/mL辣椒堿組RPMI-1640培養(yǎng)液，各加入1 mL。然后將培養(yǎng)板置于恒溫箱中培養(yǎng)48 h。離心，收集上清液，放在- 20℃環(huán)境中保存。按照ELISA試劑盒的說明書檢測細(xì)胞因子IFN-γ和IL-6含量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行一維方差統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，不同羅馬數(shù)字表示差異極顯著“P<0.01”。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒堿對脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

不同濃度組的辣椒堿組與空白對照組相比較：不同濃度的辣椒堿組淋巴細(xì)胞的OD值均極顯著（P<0.01）高于空白對照組，說明辣椒堿可以有效刺激淋巴細(xì)胞的增殖。各濃度組之間比較：濃度為50μg/mL的辣椒堿組淋巴細(xì)胞的OD值都極顯著（P<0.01）高于其他質(zhì)量濃度組，說明濃度為50μg/mL時(shí)，辣椒堿對刺激淋巴細(xì)胞增殖的效果優(yōu)于其他濃度組，并且呈現(xiàn)雙向調(diào)節(jié)。見圖1。

2.2 辣椒堿對脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

不同濃度組的辣椒堿組與空白對照組相比較：不同濃度的辣椒堿組分泌IFN-γ、IL-6的量均極顯著（P<0.01）高于空白對照組，說明辣椒堿可以有效刺激淋巴細(xì)胞因子IFN-γ、IL-6的分泌。各濃度組之間比較：濃度為50μg/mL的辣椒堿組淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-6的量均極顯著明顯高于其他濃度組，說明濃度為50μg/mL時(shí)辣椒堿對刺激淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-6的效果優(yōu)于其他濃度組，并且呈現(xiàn)雙向調(diào)節(jié)。見圖2、圖3。

3 討論

淋巴細(xì)胞在免疫應(yīng)答過程中起核心作用。只有接受抗原刺激后才能分化增殖，發(fā)生特異性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體或細(xì)胞因子，稱為免疫活性細(xì)胞[[12]。淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的分泌是評價(jià)細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)。白細(xì)胞介素是一類主要負(fù)責(zé)信號(hào)傳遞，聯(lián)絡(luò)白細(xì)胞群，調(diào)節(jié)細(xì)胞的活化、增殖和分化作用的細(xì)胞因子。IFN-γ又稱Ⅱ型干擾素或免疫干擾素，主要由T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生，可以誘導(dǎo)Thl型細(xì)胞的免疫應(yīng)答，具有免疫調(diào)節(jié)作用[13]。IL-6具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與免疫應(yīng)答和組織修復(fù)等多種生物學(xué)功能，還能增強(qiáng)IL-1對Th細(xì)胞的有絲分裂作用，促進(jìn)T細(xì)胞增殖、分化并產(chǎn)生抗體，IL-6主要免疫學(xué)功能是增強(qiáng)其他細(xì)胞因子的效果[14]。結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，辣椒堿可以刺激淋巴細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子IFN-γ、IL-6的分泌，提示辣椒堿通過激活靜止的T細(xì)胞使其活化，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞分化增殖，發(fā)生特異性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體或細(xì)胞因子。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫反應(yīng)與體液免疫反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮免疫增強(qiáng)的作用。

4 結(jié)論

辣椒堿可有效刺激脾淋巴細(xì)胞的增殖，能夠促進(jìn)其分泌細(xì)胞因子IFN-γ、IL-6，從而，提高辣椒堿對小鼠淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性。

參考文獻(xiàn)

[1]李旭偉，張俊清，羅露，等.辣椒堿對離體蟾蜍坐骨神經(jīng)動(dòng)作電位的影響[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2012，28（7）：979-980.

[2]陳茂劍，蔣瑋，覃慶洪，等.辣椒堿抗腫瘤作用分子機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2019，25（ 7）：100- 108.

[3]王夢，趙佩霞，張鵬，等.辣椒堿單體、二氫辣椒堿單體和降二氫辣椒堿單體抗氧化效果研究[J]學(xué)與生物工程，2019，36 （2）：8-11.

[4]鄭立穩(wěn)，孔學(xué)，陳貫虹，等.辣椒堿酰胺類似物的合成及抑菌活性研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，55（3）：631-633， 637.

[5]崔曉曼.黃櫻椒提取物干預(yù)脂類代謝的實(shí)驗(yàn)研究[D]杭州：浙江大學(xué)，2013.

[6]許莉妍，朱靖.辣椒堿的抗炎鎮(zhèn)痛作用研究[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，35（7）：942-944

[7]王榮雁，陳朝軍，武世奎，等.辣椒堿藥理作用的分子機(jī)制研究進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志，2016，31（1）：108-110.

[8]丁宏標(biāo)，崔海濱，吳秀麗，等.辣椒堿飼料添加劑的功能和應(yīng)用[J]飼料工業(yè)，2018，39（11）：1-5.

[9] Yan-Chun L I，Zhao L N. Zhang X Y. et al Changes ofcell surface markers C-D3. CD4. CD44. CD62L on mousespleen lymphocytes after culture in vitro[J]. Chine-se Joumal ofImmunology. 2016（ ll）：1 607-1 609

[10]Sheng X. Li T，Liu J.The effect of different fractions andcomponents in Huanglianjiedutang on the in vitro proliferation ofthe mouse splenic lymphocytes[J]. Phar-macology& Clinics ofChinese Materia Medica. 2013（1）：19-22.

[11]劉英博，付越，郝璐，等.白藜蘆醇對小鼠脾淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性的影響[J].食品工業(yè)科技，2016，37 （8）：335- 339.

[12]崔智中，崔寶安.獸醫(yī)免疫學(xué)[M].第二版北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：20-21.

基金項(xiàng)目：遼寧省自然科學(xué)基金（ 20170540369）

作者簡介：王利明（1963-），男，碩士，研究方向：獸醫(yī)藥理學(xué)與獸醫(yī)免疫學(xué)。

通信作者：李敬雙（1963-），女，碩士，教授，研究方向：獸醫(yī)藥理學(xué)與獸醫(yī)免疫學(xué)。