長鏈非編碼RNA DNM3OS在胃癌中的研究

劉 瑩 陳興銀 譚 婷 劉長青 湯順玉 李 響

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，是全球三大癌癥死亡原因。胃癌在全球的發生率因地區而異，在東亞其發生率最高[1, 2]。大多數患者首診時即發現在癌癥晚期，已經出現了轉移。盡管近年來在外科技術和放、化療方面取得了較大進展，然而晚期胃癌患者預后仍不理想[3]。因此，充分了解胃癌發展的潛在分子機制，尋找新的診斷標志物和發掘新的腫瘤侵襲轉移的治療靶點迫在眉睫。

長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類超過200個核苷酸的轉錄物質，其沒有編碼蛋白的潛能，但是多數研究表明LncRNA在腫瘤的發生、發展中發揮關鍵作用。LncRNA參與多種腫瘤生物學作用，包括腫瘤增殖、侵襲、轉移、凋亡和化療藥物的抵抗[4]。研究表明LncRNA的失調在誘導胃癌的發生和轉移中發揮重要作用[5]。DNM3OS是一種新發現的LncRNA，前期研究報道其在卵巢癌中通過誘導上皮向間質轉化促進卵巢癌的侵襲，降低其生存率。然而其在胃癌中的作用尚無報道。本研究旨在探討DNM3OS在胃癌患者中的表達及其與胃癌患者預后的關系，探討DNM3OS對胃癌細胞系的作用和機制，為胃癌的防治提供新的理論基礎。

材料與方法

1.患者樣本:腫瘤及其癌旁組織來源于2012年1月～2016年1月在筆者醫院接受手術的胃癌患者。研究方案經筆者醫院倫理學委員會批準。所有參與者均知情同意。所有患者在手術前均未接受放療或化療。所有胃癌組織標本均取后立即快速冷凍在-80℃下儲存。采用電話隨訪的方式進行隨訪，每半年1次，詢問患者再入院情況和死亡情況。

2.細胞培養和轉染:人胃上皮細胞系AGS和 MKN45(上海中國科學院細胞庫)在含有10%胎牛血清(美國Sigma公司)的RPMI-1640培養基中培養。細胞轉染：將2×105個細胞接種到6孔板中，用脂質體Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)進行細胞轉染。siRNA序列如下：si-DNM3OS: 5′-CAACTAGTGTTCAACTATA-3′。

3.RT-PCR檢測：提取胃癌組織和細胞的總RNA，用反轉錄酶XL(日本TaKaRa公司)、寡核苷酸和隨機引物將1μg總RNA反轉錄為cDNA。采用QuantStudio 5 real-time PCR 系統(美國Thermo fisher公司)以及SYBR green反應試劑盒(美國Biosystems公司)進行PCR擴增反應，以肌動蛋白β(β-actin)作為內參。

4.免疫印跡法:提取胃癌組織和細胞的總蛋白，采用裂解液裂解蛋白后離心取上清總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，采用10%是SDS-page進行凝膠電泳，將蛋白轉移到PVGF膜上，采用5%脫脂牛奶封閉30min，采用相應的一抗孵育過夜，采用熒光二抗孵育1h，采用Odessey 紅外系統進行顯色，所有蛋白與內參β-actin進行比較。

5.MTT試劑盒檢測細胞增殖:細胞接種于96孔板中，處理完畢后每孔加入10μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續培養4h。用PBS沖2～3遍后，每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀A490nm處測量各孔的吸光度值。

6.凋亡染色檢測：采用Tunel染色檢測凋亡陽性細胞數量，處理好的細胞采用4%多聚甲醛固定15min，用預冷的乙醇和冰醋酸1∶1溶液后固定，采用0.2% TritonX 200通透細胞5min，孵育TUNEL反應混合液1h，采用DAPI染色細胞核。以每個視野下綠色和藍色細胞核重疊百分數作為細胞凋亡百分數。

結 果

1.DNM3OS在胃癌組織和細胞中表達升高:RT-PCT結果顯示，與癌旁組織比較，DNM3OS在胃癌組織中的表達顯著升高(P<0.05)；與正常細胞比較，AGS細胞系中DNM3OS的表達顯著增高(P<0.05)；與正常細胞比較，MKN45細胞系中DNM3OS的表達顯著增高(P<0.05)，詳見圖1。

圖1 DNM3OS在胃癌組織和細胞中表達升高

2.DNM3OS表達與胃癌患者腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分級相關性:納入的50例患者，以DNM3OS表達的中位數為界限，將其分為DNM3OS高表達組，DNM3OS低表達組，兩組患者的腫瘤組織分化程度、Bormann分型、腫瘤直徑和神經侵犯率、血管侵犯率比較，差異無統計學意義，而T分級、N分級和TNM分級差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表1。

3.DNM3OS表達與胃癌患者生存率的關系:隨訪患者36個月，統計患者病死率，DNM3OS高表達組患者死亡15例，病死率高達50%，而DNM3OS低表達組患者死亡4例，病死率為20%，兩組存活率比較，差異有統計學意義(P<0.05)，生存率曲線詳見圖2。

4.DNM3OS沉默減少胃癌AGS細胞系的增殖，增加其凋亡：培養胃癌AGS細胞系，采用siRNA沉默DNM3OS的表達后其表達明顯低于對照組(P<0.05)，證明siRNA的轉染是成功的。MTT試驗結果顯示，在培養12、24、48和72h，對照組AGS細胞不斷增殖，而DNM3OS沉默組(si-DNM3OS)細胞增殖明顯低于對照組(P<0.05)，詳見圖3B。采用Tunel染色檢測細胞凋亡水平，對照組細胞凋亡率為5.6%±1.2%，DNM3OS沉默組細胞凋亡率為29.7%±4.5%，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見圖3C。

表1 DNM3OS的表達與胃癌患者腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分級的關系

圖2 DNM3OS表達與胃癌患者生存率的關系兩組比較，*P<0.05

5.DNM3OS沉默減少胃癌MKN45細胞系的增殖，增加其凋亡：培養胃癌MKN45細胞系，采用siRNA沉默DNM3OS的表達后其表達明顯低于對照組(P<0.05)，證明siRNA的轉染是成功的(圖4A)。MTT試驗結果顯示，在培養12、24、48和72h，對照組MKN45細胞不斷增殖，而DNM3OS沉默組(si-DNM3OS)細胞增殖明顯低于對照組(P<0.05，圖4B)。采用Tunel染色檢測細胞凋亡水平，結果顯示,

圖3 DNM3OS沉默減少胃癌AGS細胞系的增殖，增加其凋亡C.綠色為凋亡細胞，藍色為細胞核(×400);與siRNA對照組比較，*P<0.05

圖4 DNM3OS沉默減少胃癌MKN45細胞系的增殖，增加其凋亡C.綠色為凋亡細胞，藍色為細胞核(×400);與siRNA對照組比較，*P<0.05

對照組細胞凋亡率為54.6%±1.9%，DNM3OS沉默組細胞凋亡率為30.7%±3.8%，兩組比較，差異有統計學意義(P<0.05，圖4C)。

6.DNM3OS 調控Akt信號分子：免疫印跡法檢測結果顯示，在AGS細胞系中，DNM3OS沉默組Akt的磷酸化水平明顯低于對照組(P<0.05，圖5A)；在MKN45細胞系，DNM3OS沉默組Akt的磷酸化水平同樣明顯低于對照組(P<0.05，圖5B)。

圖5 DNM3OS 調控Akt信號分子

討 論

研究表明LncRNAs在腫瘤的各種生命過程中發揮關鍵作用，這表明其可以作為判斷腫瘤預后的分子標志物和治療靶點[6,7]。目前為止，多數研究發現在胃癌組織中多種LncRNA表達失調，包括GCLNC1、PANDAR、MALAT1、GCRL1[8～10]。本研究發現與相鄰正常組織比較,LncRNA DNM3OS在胃癌組織中顯著上調。且DNM3OS高表達的患者腫瘤侵襲、淋巴結轉移、TNM分期明顯差于DNM3OS低表達患者。DNM3OS高表達患者的生存率也低于預后DNM3OS低表達患者。這些結果表明，DNM3OS可能是作為潛在的胃癌預后判斷的生物學標志物。為了進一步評估DNM3OS在胃癌細胞發展中的作用，筆者采用DNM3OS siRNA對兩種胃癌細胞增殖和凋亡的影響。結果表明，DNM3OS沉默抑制了胃癌細胞增殖，促進胃癌細胞的凋亡。這些結果表明DNM3OS在胃癌細胞中發揮腫瘤促進作用。

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[11]。Akt是Akt/PI3K/PTEN信號通路中的關鍵蛋白。Akt一旦被磷酸化激活，在惡性轉化過程中起著重要作用[11,12]。磷酸化Akt(P-Akt)通過激活下游的哺乳動物雷帕霉素干擾細胞凋亡、促進細胞增殖和運動[13]。過度表達的P-Akt被認為是許多惡性腫瘤預后不良的重要指標[14～16]。一項Meta分析表明，P-Akt高表達與乳腺癌患者的總體生存率差顯著相關[17]。P-Akt表達升高與非小細胞肺癌患者生存率低顯著相關[18]。此外，P-Akt表達升高與胃癌患者預后差明顯相關[19]。而本研究發現，在DNM3OS沉默后AGS胃癌細胞系和MKN45胃癌細胞系中Akt的激活明顯下調，提示DNM3OS可能通過上調Akt促進胃癌細胞的增殖，抑制其凋亡發揮促胃癌發生、發展的作用。

綜上所述，DNM3OS在胃癌中高表達，其可能作為新的生物學標志物用于判斷胃癌患者的預后；DNM3OS可能通過促進Akt的活化促進胃癌細胞的生存和進展。本研究為胃癌治療提供了新思路，未來基于DNM3OS為靶點的新藥物可能成為治療胃癌的新策略。