外周血ADAM8、IRF1表達水平與支氣管哮喘患兒肺功能的相關性研究

王開梅 胡祥英 鄭光強 邱文海 林志雄

[摘要] 目的 研究外周血去整合素金屬蛋白酶8（ADAM8）、干擾素調控因子1（IRF1）的表達水平與支氣管哮喘（BA）患兒肺功能的相關性。 方法 選擇2018年1～8月在海口市婦女兒童醫院（以下簡稱“我院”）接受治療的84例BA患兒作為觀察組，根據病情嚴重程度將其分為輕度組（30例）、中度組（44例）、重度組（10例）。另選同期在我院進行體檢的健康兒童80名作為對照組。檢測并比較各組肺功能指標及外周血ADAM8、IRF1的mRNA及蛋白表達水平，分析觀察組患兒外周血ADAM8、IRF1的蛋白表達與其肺功能指標的相關性。 結果 觀察組及輕、中、重度組外周血ADAM8、IRF1的mRNA及蛋白表達水平均明顯高于對照組，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）;重度組和中度組外周血ADAM8、IRF1的mRNA及蛋白表達水平明顯高于輕度組，且重度組高于中度組，差異均有統計學意義（P < 0.05）。觀察組及輕、中、重度組患兒第1秒用力呼氣容積（FEV1）、FEV1與用力肺活量的比值（FEV1/FVC）及呼氣峰流速（PEF）均低于對照組，差異均有統計學意義（P < 0.05）;重度組和中度組FEV1、FEV1/FVC及PEF均明顯低于輕度組，且重度組低于中度組，差異均有統計學意義（P < 0.05）。Pearson相關性分析結果示，患兒外周血ADAM8、IRF1的蛋白表達與其FEV1、FEV1/FVC及PEF均呈負相關（rADAM8=-0.780、-0.773、-0.682，均P < 0.01;rIRF1=-0.684、-0.710、-0.768，均P < 0.01）。 結論 BA患兒外周血ADAM8和IRF1表達水平明顯升高，且二者與肺功能具有密切關系，臨床上可考慮將二者納入BA患兒的監測靶點，從而輔助診治過程。

[關鍵詞] 外周血;去整合素金屬蛋白酶8;干擾素調控因子1;支氣管哮喘;肺功能;相關性

[中圖分類號] R725.6? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）08（c）-0095-05

[Abstract] Objective To study the correlation of the expression of deintegrin metalloproteinase 8 （ADAM8）， interferon regulatory factor 1 （IRF1） in peripheral blood and pulmonary function in children with bronchial asthma （BA）. Methods Eighty-four children with BA who were treated in Haikou Women & Children Hospital （"our hospital" for short） from January to August 2018 were selected as observation group， and they were divided into mild group （30 cases）， moderate group （44 cases） and severe group （10 cases） according to the severity of the disease. Eighty healthy children who underwent physical examination in our hospital at the same time were selected as control group. The pulmonary function indices， the expression levels of ADAM8， IRF1 mRNA and protein in peripheral blood of each group were detected and compared. The correlation between the expression of ADAM8， IRF1 protein in peripheral blood and pulmonary function indices was analyzed. Results The expression levels of ADAM8， IRF1 mRNA and protein in peripheral blood of observation group and mild， moderate， severe group were significantly higher than those of the control group， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）; the expression levels of ADAM8， IRF1 mRNA and protein in peripheral blood of the severe group and moderate group were significantly higher than the mild group， and those of the severe group were significantly higher than the moderate group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The forced expiratory volume in 1 second （FEV1）， FEV1/forced vital capacity （FEV1/FVC）， peak expiratory flow （PEF） in the observation group and mild， moderate， severe group were significantly lower than the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The levels of FEV1， FEV1/FVC and PEF in the severe group and moderate group were significantly lower than the mild group， while the severe group was significantly lower than the moderate group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Pearson correlation analysis showed that， the expression of ADAM8， IRF1 protein was negatively correlated with FEV1， FEV1/FVC and PEF （rADAM8=-0.780， -0.773， -0.682， P < 0.01; rIRF1=-0.684， -0.710， -0.768， P < 0.01）. Conclusion The expression of levels ADAM8 and IRF1 in peripheral blood of children with BA are significantly increased， and it is closely related to pulmonary function. It can be considered as the monitoring target of children with BA， in order to assist the diagnosis and treatment process.

[Key words] Peripheral blood; Deintegrin metalloproteinase 8; Interferon regulatory factor 1; Bronchial asthma; Pulmonary function; Correlation

支氣管哮喘（bronchial asthma，BA）屬于兒童時期的常見病及多發病，患兒通常會產生急性發作的癥狀，如出現呼吸道平滑肌的持續性痙攣，損害正常肺通氣功能，并可引起呼吸功能障礙，常需及時予以藥物干預[1]。臨床治療BA的藥物主要有糖皮質類激素藥物和長效β2激動劑等，雖能產生一定的療效，但在患兒病情較重時則應用效果不佳，這就使得尋找新型治療靶點顯得尤為重要[2]。去整合素金屬蛋白酶8（deintegrin metalloproteinase 8，ADAM8）屬于保守性較高的跨膜分泌糖蛋白，其與氣道炎癥細胞在機體內的遷移具有一定關聯。干擾素調控因子1（interferon regulatory factor 1，IRF1）屬于轉錄因子的一個家庭成員，其可在細胞免疫及分化過程中發揮作用[3-4]。本研究通過分析外周血ADAM8及IFR1表達與BA患兒肺功能的關性，旨在為臨床診治BA選擇新型監測靶點，并提供數據支持，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年1～8月在海口市婦女兒童醫院（以下簡稱“我院”）接受治療的BA患兒84例作為觀察組。納入標準：①符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[5]中關于BA的診斷標準;②年齡≤12歲;③患兒家屬對本研究知情并簽署知情同意書。排除標準：①合并呼吸系統其他疾病者;②合并血液系統疾病、感染性或免疫性疾病者;③有創傷或惡性腫瘤者;④入組前4周內應用過激素及免疫抑制劑等藥物治療者。84例觀察組患兒中，男43例，女41例;年齡4～12歲，平均（7.95±0.45）歲;平均病程（18.36±3.20）個月。根據《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[5]中病情嚴重程度評分標準將BA患兒分為輕度組（30例）、中度組（44例）、重度組（10例）。另選同期在我院進行體檢的健康兒童80名作為對照組，男45名，女35名;年齡5～12歲，平均（7.97±0.59）歲。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。本研究已經我院醫學倫理委員會審核及批準。

1.2 儀器與試劑

瑞士Roche公司生產的TRIzol（貨號：15596026）;瑞士Roche公司生產的蛋白裂解液（批號：161306）;BECKMAN OPTIMA XPN-100超速離心機，離心半徑為10 cm;日本TaKaRa公司生產的Takara反轉錄試劑盒（貨號：638313）;美國伯樂公司生產的Bio-Rad PCR儀（貨號：179203）;賽默飛世爾科技（中國）有限公司生產的SYBR Green Master Mix、BCA試劑盒（貨號：23221）;天根生化科技（北京）有限公司生產的RNase-free H2O（貨號：RT121-02）、LcDNA（貨號：KR202-01）;購自上海聯邁生物工程有限公司的ADAM8酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒（貨號：10548）、IRF1 ELISA試劑盒（貨號：10511）。

1.3 標本采集

入組后晨間抽取各組受試者空腹靜脈血6 mL，置入乙二胺四乙酸抗凝管內，通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心法將外周血的血清及單個核細胞進行分離，并將血清分裝進200 μL的EP管中，置于-70℃冰箱中保存。單個核細胞添加200 μL TRIzol或200 μL蛋白裂解液后，置于-70℃冰箱中保存。

1.4 熒光定量PCR法測定ADAM8、IRF1的mRNA表達

通過TRIzol法將外周血中單個核細胞的總RNA予以提出，并通過Takara反轉錄試劑盒進行cDNA的合成，其中ADAM8的正向引物為5′-GGGAGAAAC-AACGAAGTTG-3′，反向引物為5′-GGTGTGATCAA-GCACAGAT-3′;IRF1的正向引物為5′-GCGGCACCTGGCGCACGGCT-3′，反向引物為5′-GGTGGCAA-GCACCAAGAC-3′;β-actin的正向引物為5′-GTGA-CGTGGACAATCCGCAAG-3′，反向引物為5′-GGAA-GGTGGACAACGGACGC-3′。反應體系為10 μL，其中含0.5 μL的100 ng/μL cDNA，5 μL的SYBR Green Master Mix，10 μmol/L的正/反向引物各有0.4 μL，3.7 μL的RNase-free H2O。通過Bio-Rad PCR儀實施擴增。設置反應條件：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，40個循環。通過2-△△Ct法實施數據分析，對每個樣品實施3次重復。

1.5 Western blot法測定ADAM8及IRF1蛋白表達

提出外周血內的單個核細胞有關總蛋白，通過BCA試劑盒檢測蛋白總量。ADAM8及IRF1單克隆抗體干粉試劑（購自美國的Santan Cruz公司，貨號：159472、163108），鼠源性單克隆抗體肌動蛋白（β-actin）及辣根過氧化物酶所標記的羊抗鼠二抗（購自北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號：257060、203471）。其中一抗的稀釋度為1∶500，二抗的稀釋度為1∶1000。將β-actin蛋白設置為內參，采用Western blot法測定血清ADAM8蛋白水平及單個核細胞內IRF1蛋白的表達水平，本次實驗重復3次，并用Tanon全自動化學發光圖像分析系統實時圖像采集，對蛋白表達水平實施半定量分析。

1.6 肺功能測定

采用法國迪爾肺功能測定儀檢測各組受試者肺功能，所有指標均一次性同步檢測，每項檢測需重復至少3次，確保數值變化<5%，將最佳值用于數據分析。主要檢測指標包含：①第1秒用力呼氣容積（FEV1）;②FEV1與用力肺活量的比值（FEV1/FVC）;③呼氣峰流速（PEF）[6]。

1.7 統計學方法

采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析，計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗;計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗;相關性分析采用Pearson法進行。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組外周血ADAM8、IRF1的mRNA及蛋白表達水平比較

觀察組的外周血ADAM8、IRF1的mRNA及蛋白表達水平均明顯高于對照組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。觀察組各亞組外周血ADAM8、IRF1的mRNA及蛋白表達水平比較，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。觀察組各亞組ADAM8、IRF1的mRNA相對表達量及蛋白表達水平均高于對照組，且重度組和中度組高于輕度組，重度組高于中度組，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖1、表1。

2.2 各組肺功能指標的比較

觀察組的FEV1、FEV1/FVC及PEF水平明顯低于對照組，差異有高度統計學意義（P < 0.05）。觀察組各亞組肺功能指標比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。觀察組各亞組的FEV1、FEV1/FVC及PEF水平低于對照組，且重度組和中度組低于輕度組，重度組低于中度組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 患兒外周血ADAM8、IRF1的蛋白表達與其肺功能指標的相關性分析

Pearson相關性分析結果示，患兒外周血ADAM8、IRF1的蛋白表達與其FEV1、FEV1/FVC以及PEF均呈負相關（rADAM8=-0.780、-0.773、-0.682，均P < 0.01;rIRF1=-0.684、-0.710、-0.768，均P < 0.01）。

3 討論

臨床上，BA屬于一類十分常見的呼吸系統疾病，其在兒童群體中的發病率較高，且近年來的發病率增高趨勢越來越明顯。BA患兒通常會表現出呼吸困難、胸悶，以及咳嗽、喘息等諸多癥狀，且在過敏原刺激等多種因素的誘導下較易產生急性發作的現象，對患兒的日常生活造成了較大的危害[7]。目前認為，在BA患兒疾病進展中，炎癥和免疫反應產生了重要的作用[8-9]。患兒呼吸系統在長期炎癥的影響下，氣道高反應明顯加劇，喘息和呼吸困難等癥狀反復發作，最終可能致使肺部通氣功能障礙，并導致氣道狹窄，從而進一步增加治療難度。目前，臨床上治療BA的藥物主要是長效β2激動劑以及皮質類固醇等，雖然具有一定的療效[10-13]，但對于重度BA的療效并不顯著。因此，尋找新型治療靶點對于重度BA而言十分必要。近年來大量研究發現，ADAM8和IRF1與機體內的炎癥及免疫反應聯系緊密，因此分析二者與BA患兒肺功能之間的關系，可能有助于更好地診治BA[14-15]。

FEV1、FEV1/FVC及PEF為常用的監測肺功能的重要指標，ADAM8和IRF1與免疫炎性反應有關。本研究發現，觀察組的FEV1、FEV1/FVC及PEF水平較對照組明顯降低，提示BA患兒的肺功能明顯下降;而外周血ADAM8、IRF1的mRNA及蛋白表達水平明顯升高，分析原因，肺功能的下降主要與患兒的呼吸系統受損有關，ADAM8、IRF1的表達上升提示二者均參與到了BA的發病進程中。ADAM8是分泌性糖蛋白有關金屬蛋白酶的家族成員，其在嗜酸/中性粒細胞及巨噬細胞，以及單核細胞等免疫細胞中均可表達，并能調節炎癥細胞的遷移過程，還可使炎癥細胞自肺部清除，具有一定的抗炎特性[16-18]。然而，ADAM8與氣道內的炎癥細胞和嗜中性粒細胞聚集過程也存在一定關系，可使炎癥細胞逐漸向BA患兒的氣道遷移，而高水平的ADAM8表達則可誘導BA形成，最終促進病情的發展。IRF屬于轉錄因子的一種，其主要定位在細胞核，可經干擾素的信號通路（γ-干擾素/Jak/STAT1）有效參與到多種基因的表達過程中，并可參與細胞免疫及細胞分化等病理生理性過程[19-21]。IRF的高表達主要可能通過免疫炎性反應對BA患兒的肺功能產生影響，最終加速了病情的進展。同時，本研究還發現，隨著患兒病情的加重，ADAM8和IRF1的表達水平明顯升高，而肺功能則明顯減弱。進一步發現，患兒外周血ADAM8和IRF1的蛋白表達與其FEV1和FEV1/FVC，以及PEF均呈負相關，提示ADAM8、IRF1的表達與BA患兒的病情進展及肺功能受損密切相關。原因考慮是與ADAM8、IRF1二者通過對B淋巴細胞、單核細胞及樹突狀細胞等有關免疫細胞和炎性反應的共同調節作用有關。這同時也提示臨床上可通過監測ADAM8、IRF1在BA患兒外周血中的表達情況以輔助診治，在既往的報道[22-24]中也有類似結論。需要指出的是，本次研究也存在一定的不足，比如研究樣本比較少、研究涉及面相對較窄，今后可通過邀請同級及上級醫療機構共同開展大樣本容量的綜合研究，從而獲得更具代表性及精準性的研究結論。

綜上所述，BA患兒外周血ADAM8和IRF1的表達水平明顯升高，且二者與肺功能具有密切的關聯，臨床上可考慮將二者納入BA患兒的監測靶點，從而輔助診治過程。

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（收稿日期：2018-11-16? 本文編輯：任? ?念）