髓核間充質干細胞生物學特性與椎間盤Pfirrmann分級相關性研究

方世兵　伍耀宏　陳云生　陳勤　徐燦華　潘其林

[摘要] 目的 研究不同Pfirrmann分級椎間盤中髓核間充質干細胞（human nucleus pulposus mesenchymal stem cells，hNP-MSCs）的生物學特性，進一步明確hNP-MSCs在椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IVDD）中的作用及其相關性。 方法 選取2017年1月～2019年1月我院椎間盤髓核摘除術的患者，根據術前MRI按Pfirrmann分級標準（Ⅰ～Ⅴ級）分為5組，各組均為3例，共15例，評價hNP-MSCs在不同椎間盤退變中的生物學特性差異及其與椎間盤退變程度的相關性。 結果 PfirrmannⅠ～Ⅴ級5組共15例標本均分離獲取到了hNP-MSCs原代細胞，貼壁時間及80%～90%融合率時間差異有統計學意義（P<0.05），Pfirrmann分級越高，細胞生長所需時間越長，細胞形態及增殖集落越不均一。酶標儀檢測不同Pfirrmann分級的5組hNP-MSCs標本接種后第1、3天，不同組hNP-MSCs標本OD值差異無統計學意義（P>0.05），第5、7、9、11、13天，不同組hNP-MSCs標本OD值差異有統計學意義（P<0.05），Pfirrmann分級超高，OD值越低，提示增殖能力與Pfirrmann分級呈負相關性。不同Pfirrmann分級的5組hNP-MSCs標本P2代細胞流式細胞儀檢測結果顯示均為高表達CD44、CD73、CD90、CD105，低表達CD31、CD34、CD45，各組CD44、CD73、CD90、CD105陽性表達率差異有統計學意義（P<0.05），且隨Pfirrmann分級的增加，陽性表達率下降，呈負相關性。 結論 hNP-MSCs的生物學特性與椎間盤Pfirrmann分級密切相關，椎間盤退變程度越重，hNP-MSCs的生物學表現越差。

[關鍵詞] 髓核間充質干細胞;Pfirrmann分級;生物學特性;OD值;相關性

[中圖分類號] R681.53? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）22-0039-05

[Abstract] Objective To study the biological characteristics of human nucleus pulposus mesenchymal stem cells （hNP-MSCs） in different Pfirrmann graded intervertebral discs， and to further clarify the role and relevance of hNP-MSCs in intervertebral disc degeneration （IVDD）. Methods Patients who underwent nucleus pulposus removal from January 2017 to January 2019 in our hospital were divided into 5 groups according to the preoperative MRI according to the Pfirrmann grading standard（Ⅰ-Ⅴ grade）， with 3 cases in each group and 15 cases totally. The differences in biological characteristics of hNP-MSCs in different intervertebral disc degeneration and their correlation with the degree of intervertebral disc degeneration. Results The primary cells of hNP-MSCs were isolated from 15 specimens of Pfirrmann Ⅰ-Ⅴ group. There were statistically significant differences in the time of adherence time and the time of 80%-90% fusion rate（P<0.05）. The higher the Pfirrmann grade， the longer it took for cells to grow， and the more uniform the cell morphology and proliferation colonies. 5 groups of hNP-MSCs specimens from different Pfirrmann grades were detected by microplate reader on the first and third days after inoculation. The differences in OD values of hNP-MSCs in different groups were not statistically significant（P>0.05）. On the 5th， 7th， 9th， 11th， and 13th day， the difference of OD values between different groups of hNP-MSCs was statistically significant （P<0.05）. The higher Pfirrmann grade， the lower the OD value， indicating that the proliferation ability was negatively correlated with Pfirrmann classification. Flow cytometry results of P2 generation of hNP-MSCs samples in 5 groups from different Pfirrmann grades showed high expression of CD44， CD73， CD90 and CD105， low expression of CD31， CD34 and CD45. The difference in positive expression rate of CD44， CD73， CD90， CD105 in each group was statistically significant （P<0.05）. And with the increase in Pfirrmann grading， the positive expression rate decreased and was negatively correlated. Conclusion The biological characteristics of hNP-MSCs are closely related to the Pfirrmann classification of the intervertebral disc. The more severe the degeneration of the intervertebral disc， the worse the biological performance of hNP-MSCs.

[Key words] Nucleus pulposus mesenchymal stem cells; Pfirrmann classification; Biological characteristics; OD value; Correlation

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IVDD）是引起頸肩腰腿痛的主要原因。近年來，細胞治療干預早期IVDD是當前的熱點研究。然而，IVDD的機制尚不明確，這對IVDD生物治療的時機及治療方法提出了挑戰。椎間盤干細胞的修復作用在IVDD中起著至關重要的作用，其中以髓核間充質干細胞（human nucleus pulposus mesenchymal stem cells，hNP-MSCs）作用最為明顯。雖然目前已證明了hNP-MSCs退變是引起IVDD的重要因素，但并未對退變椎間盤進行分級。IVDD是一個漫長的過程，不同退變程度椎間盤表現出不同的生物學活性及特征，所以基于當前hNP-MSCs與椎間盤退變的所有研究，無法明確椎間盤退變過程中hNP-MSCs的生物學功能差異。因此，研究不同Pfirrmann分級椎間盤中hNP-MSCs的功能差異，對進一步闡明hNP-MSCs在椎間盤退變中的作用具有重要指導意義，為進一步闡述椎間盤干細胞在椎間盤退變過程中的作用機制提供了新方法。

1 材料與方法

1.1 一般材料

選擇2017年1月～2019年1月贛州市人民醫院脊柱外科接受椎間盤髓核摘除術的患者，根據術前MRI按Pfirrmann分級標準（Ⅰ～Ⅴ級）分為5組，各組均為3例，共15例。其中男9例、女6例，年齡16～51歲，平均38.5歲;頸椎椎間盤5例，胸椎2例，腰椎8例;病種為頸椎骨折2例、頸椎病3例、結構性脊椎側彎畸形2例、腰椎間盤突出癥及腰椎滑脫8例。基于核磁共振檢查結果的Pfirrmann分級主觀評價差異大，為去除主觀差異，需要經過3個不同的影像科醫師進行評分分級，經過2個醫師同意即可作為該樣本最終分級。Ⅰ級的椎間盤見于健康的青少年，本研究中采用頸椎骨折1例（23歲）及脊柱側彎畸形2例（16～21歲）的變異節段的椎間盤作為代替，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級取自接受椎間盤切除融合手術的患者，本實驗患者知情同意并獲醫院倫理委員會的批準，所有受試者均簽署知情同意書，未成年者由監護人簽署。

1.2 儀器及試劑

流式細胞儀（Millipore 美國），Moflo高速流式細胞分選儀（Dako cytomation 美國），離心機（Hereaus德國），細胞計數試劑盒（CCK-8日本），細胞培養板（Corning 美國），磷酸鹽緩沖液PBS（Sigma 美國），倒置顯微鏡（Olympus日本），胰蛋白酶（Solaibo美國），Ⅱ型膠原酶（Gibico美國），胎牛血清（Hyclone美國），DMEM低糖培養基（Cyagen Biosciences中國），青霉素-鏈霉素（Hyclone 美國），熒光單克隆抗體CD90-APC、CD73-APC、CD105-APC、CD44-APC、CD31-APC、CD34-APC、CD45-APC（Abcam 美國）。

1.3 分離培養獲取hNP-MSCs

將手術中切下的椎間盤組織（術前按Pfirrmann分級分組）立即送中心實驗室處理，無菌條件下超凈臺上生理鹽水清洗血塊等表面雜質，眼科剪剔除椎間盤的纖維環及軟骨終板組織，仔細分離髓核組織，PBS清洗2遍，剪碎至1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm大小，置于0.02 mg/mL的Ⅱ型膠原酶溶液中，5%CO2、37℃培養箱中消化過夜，次日取出并用200 μm無菌鋼絲網過濾組織碎片。1500轉/min離心4 min，棄上清液，收集細胞，加至含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM低糖培養基中，吹打混勻，置入5%CO2、37℃培養箱培養，貼壁后每2～3天換液1次，待細胞融合至80%～90%時進行傳代培養，0.25%胰酶、0.02%EDTA消化3 min，按照5×103個細胞/cm2重新接種于培養瓶進行傳代培養，取P2代細胞至80%～90%融合時，提取hNP-MSCs進行實驗研究。

1.4 細胞形態學觀察

在hNP-MSCs分離培養過程中，利用倒置顯微鏡，每天對細胞形態及細胞融合率進行觀察，拍照并記錄形態學及集落形成特征。

1.5 hNP-MSCs增殖能力的檢測

細胞增殖能力用CCK-8進行檢測，將不同分組的P2代hNP-MSCs，胰蛋白酶消化，調整細胞懸液密度，按照每孔5×104個細胞/mL、200 μL培養基接種于96孔板，每組6個復孔，以不含細胞的培養液為空白對照組。將96孔板放置于溫度為37℃、體積分數為5%的CO2培養箱中培養，分別于接種后第1、3、5、7、9、11、13天檢測細胞增殖情況，在各組每孔添加10 μL CCK-8溶液（包含空白對照組），作用4 h后用檢測波長為450 nm酶標儀測定光密度（OD）值，將各細胞培養孔所得OD值減去陰性空白對照OD值后，計算不同組別培養基組hNP-MSCs的平均OD值，比較細胞增殖活力，并繪制細胞增殖曲線。

1.6 免疫表型的檢測

各組取P2代細胞，消化制備細胞懸液，調整濃度為1×105/mL，每管取細胞1 mL，PBS清洗后，分別加入熒光單克隆抗體CD90-APC、CD73-APC、CD105-APC、CD44-APC、CD31-APC、CD34-APC、CD45-APC，每管共100 μL細胞懸液，根據同型對照的熒光強度設陰性對照組（不加任何抗體）。將每管標本與抗體混勻后室溫避光孵育，20 min后用2 mL PBS清洗后棄上清，重懸于400 μL PBS（含1%多聚甲醛）FC500流式細胞儀上檢測，觀察各組hNP-MSCs每種單抗的陽性細胞表達率，Cellquest軟件分析結果。

1.7 統計學方法

采用SPSS 14.0統計軟件進行數據統計學分析，計量資料結果以（x±s）表示，對不同組hNP-MSCs不同培養天數的細胞OD值，CD90、CD73、CD105、CD44、 CD31、CD34、CD45的陽性表達率進行方差齊性檢驗后，采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組hNP-MSCs培養P2代貼壁時間（h）及80%～90%融合率時間

PfirrmannⅠ～Ⅴ級5組共15例標本均分離獲取到了hNP-MSCs原代細胞，各組在接種后不同時間出現貼壁，P0代細胞形態多為長短不一的短梭紡錘形，為散在不規則貼壁生長（封三圖4），約12～19 d細胞融合率可達80%～90%。P1代細胞生長較P0代明顯增快，貼壁時間更短，細胞排列緊密、形態更均一，呈螺旋狀（封三圖5），接種后約10～17 d細胞達80%～90%融合。P2代細胞形態基本保持一致，貼壁快、約4～6 h，呈典型的長梭形，排列更加緊密、整齊，呈漩渦狀排列生長（封三圖6），約6～12 d細胞融合率即可達80%～90%。5組標本P2代貼壁生長時間、80%～90%細胞融合率時間（表1），差異有統計學意義（P<0.05），Pfirrmann分級越高，細胞生長所需時間越長，細胞形態及增殖集落越不均一。

2.2 不同Pfirrmann分組hNP-MSCs不同培養時間的OD值

酶標儀檢測不同Pfirrmann分級的5組hNP-MSCs標本接種后第1、3、5、7、9、11、13天的OD值結果見表2。細胞增殖結果顯示，培養第1、3天，不同組的hNP-MSCs標本OD值差異無統計學意義（P>0.05），第5、7、9、11、13天，不同組的hNP-MSCs標本OD值差異有統計學意義（P<0.05），Pfirrmann分級越高，OD值越低，提示增殖能力與Pfirrmann分級呈負相關性。

2.3 各組hNP-MSCs標本P2代細胞表面標志物表達率

不同Pfirrmann分級的5組hNP-MSCs標本P2代細胞流式細胞儀檢測結果顯示均為高表達CD44、CD73、CD90、CD105，低表達CD31、CD34、CD45（表達率見表3），各組CD44、CD73、CD90、CD105陽性表達率差異有統計學意義（P<0.05），且隨Pfirrmann分級的增加，陽性表達率下降，呈負相關性。

3 討論

大量研究已證實，IVDD是脊柱相關疾病的主要原因之一，機制主要為椎間盤退變致膨出及突出，出現神經根壓迫及炎性病變的發生，從而出現疼痛等相應臨床表現，嚴重影響了人們的生活質量[1]。椎間盤主要由終板軟骨、纖維環和髓核組織3部分組成，主要構成為膠原蛋白和蛋白糖類[2]，營養主要來自椎體軟骨終板的毛細血管床[3]。IVDD的機制為尚不明確，研究報道多種因素可引起椎間盤退變，過程復雜[4-5]，Stemple DL[6]認為髓核細胞形態改變，凋亡率和死亡率增加，細胞外基質（蛋白多糖、Ⅱ型膠原等）合成減少是IVDD主要原因。目前尚無一種切實有效的治療或阻止椎間盤退變的方法。髓核組織中存在hNP-MSCs[7]，其可通過調節分泌作用，刺激退變的椎間盤進行內在修復[8]。近年來，干細胞移植成為IVDD生物學治療的研究熱點，有研究發現，自體hNP-MSCs植入退變椎間盤組織內能明顯延緩IVDD的發展進程[9]，然而，自體hNP-MSC并不容易獲取足量細胞，且在獲取細胞時往往引也正常椎間盤退變或原來退變加重，反而加重患者病情，成為自體干細胞移植應用臨床最大的障礙。有學者嘗試采用不同方法激活已退變椎間盤內的hNP-MSCs來阻止或逆轉IVDD，查相關的文獻報道尚少，本課題受此啟發，研究不同退變程度的椎間盤組織內hNP-MSCs生物活性，進一步闡明hNP-MSCs在椎間盤退變中的作用和機制，明確兩者相關性，為生物治療椎間盤退變提供合適的治療時機與合理的治療方法。

椎間盤退變程度評估的方法有很多，最常用的有X線片、CT片、椎間盤造影、MRI檢查及術中實體觀察等。其中以MRI應用最多，Pfirrmann分級是通過MRI對椎間盤退變進行評估的一種方法，依據MR T2WI圖像判斷椎間盤退變的程度，它從解剖學角度清楚地描述了椎間盤退變的形態學改變，可以較好地反映椎間盤早期的退行性改變，為無創、有效、準確及可行性強等特點，已廣泛應用于臨床與科研[10-11]。Pfirrmann分級法是依據T2WI信號強度、信號是否均質、髓核與纖維環的分界是否清晰和椎間盤的高度等指標建立了腰椎間盤退變的MRI分級體系，分為Ⅰ～Ⅴ級。本研究采用Pfirrmann分級法對椎間盤退變進行評估，按Ⅰ～Ⅴ級分為5組，各組均取3個標本，共15個。Ⅰ、Ⅱ級見于正常青少年的椎間盤組織，其中Ⅰ為健康的青少年，臨床上行椎間盤摘除手術相對較少，取材資源少，本課題3例標本來源于少年先天性脊椎側彎畸形手術，在行椎體截骨取出下椎間盤組織。Ⅱ級3例標本來源于頸椎骨折青年患者，椎間盤信號呈均勻白色，髓核與纖維環的分界清晰，在行前路穩定手術（頸椎融合）中切取的椎間盤組織。Ⅲ級椎間盤髓核T2WI信號呈灰色、不均勻，髓核與纖維環的分界模糊，椎間椎高度輕度降低，標本1個取自頸椎病、2個取自腰椎間盤突出患者。Ⅳ級髓核T2WI信號呈灰色或黑色，與纖維環的分界消失，高度中度降低，3例標本取腰椎間盤突出。Ⅴ級髓核信號比Ⅳ級更黑，伴有椎間高度塌陷，因退變嚴重，實驗中分離髓核相對困難，標本取自重型頸椎病及腰椎滑脫患者。實驗過程中，各級標本均分離培養到了符合標準的hNP-MSCs，能滿足實驗要求。

椎間盤退變時，髓核組織退變最明顯，對于椎間盤退變有重要影響[12]，其進程為不可逆性，既往研究認為椎間盤本身不具備修復能力[13]。隨著對椎間盤組織及細胞生化研究的廣泛深入開展，Risbud首次報道了椎間盤髓核組織中存在hNP-MSCs，該細胞特征性表達一系列間充質干細胞（MSCs）表面蛋白分子、可完成三系誘導分化，符合國際細胞治療學會（International Society for Cellular Therapry，ISCT）有關MSCs 的界定標準[14]，MSCs是體內一類特殊的細胞群體， 其具有自我更新及多向分化能力[15-17]。通過激活hNP-MSCs的生物活性來治療IVDD，現已成為熱點，并有大量的相關基礎研究報道[18-20]。退變對hNP-MSCs的生物活性的影響及相關性的研究比較少見，我們選取需切除椎間盤的患者，年齡16～51歲，排除腫瘤、結核等疾病，術前根據MRI結果明確Pfirrmann分級，按不同分級進行分組納入實驗研究。手術中獲取椎間盤髓核組織標本，酶消化法分離髓核間充質干細胞，比較不同分級髓核間充質干細胞的形態、增殖、集落形成、干細胞免疫表型，評價髓核間充質干細胞在不同椎間盤退變中的生物學特性差異及其與椎間盤退變程度的相關性。均數采用（x±s）表示，對不同組hNP-MSCs不同培養天數的細胞OD值，CD90、CD73、CD105、CD44、CD31、CD34、CD45的陽性表達率進行方差齊性檢驗后，采用獨立樣本t檢驗。基于核磁共振檢查結果的Pfirrmann分級主觀評價差異大，為去除主觀差異，需要經過3個不同的影像科醫師進行評分分級，經過2個醫師同意即可作為該樣本最終分級。本研究結果顯示不同Pfirrmann分級的hNP-MSCs形態不同，分級越高，細胞越不規則，而且貼壁時間與80%～90%細胞融合率時間也隨退變的加重而延長。增殖能力及免疫表型檢測顯示，椎間盤退變越重，其增殖能力越差、細胞免疫標志物的陽性率也明顯減低。本研究在不同退變程度的椎間盤內均可培養出hNP-MSCs，但實驗結果充分證明了隨著椎間盤退變程度的加重，hNP-MSCs生物活性變差。本實驗首次研究Pfirrmann退變程度與髓核間充質干細胞生物學特性的相關性，為進一步闡述椎間盤干細胞在椎間盤退變過程中的作用機制提供了新方法。

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（收稿日期：2019-04-16）