環(huán)境微生物監(jiān)測技術(shù)及其質(zhì)量控制

丁奕銘

摘要：為保證環(huán)境微生物監(jiān)測中結(jié)果的準確性和可靠性、提高監(jiān)測人員的操作水平，提出了環(huán)境微生物監(jiān)測的技術(shù)及質(zhì)控措施，指出了微生物監(jiān)測中各環(huán)節(jié)存在的常見問題，有助于保證監(jiān)測結(jié)果的質(zhì)量，為建立微生物檢測質(zhì)量控制體系提供參考。論述了環(huán)境微生物監(jiān)測全流程中的質(zhì)控要點和方法，以達到對環(huán)境微生物監(jiān)測過程的全面質(zhì)量控制的目的。

關(guān)鍵詞：環(huán)境監(jiān)：測;微生物檢測;質(zhì)量控制

中圖分類號：X835 文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2019）14-0155-02

1引言

微生物監(jiān)測是環(huán)境監(jiān)測中一類比較特殊的項目。由于微生物具有生物性和多樣性，其在樣品中的濃度會隨時間和外部環(huán)境的變化而產(chǎn)生較大的差異。其特性導(dǎo)致了其樣品有效期短，重復(fù)性差，檢測要求高，且人員操作水平高低常導(dǎo)致結(jié)果的差異性。而國內(nèi)尚未有系統(tǒng)化的微生物監(jiān)測技術(shù)規(guī)范出臺，故筆者參考有關(guān)標準及文獻，論述微生物監(jiān)測中的采樣、儀器、設(shè)備、檢測方法及培養(yǎng)基等檢測全過程中常見的技術(shù)要點及質(zhì)控措施，給各機構(gòu)建立微生物檢測質(zhì)量控制體系提供參考。

2樣品采集前的準備

水質(zhì)樣品采集的容器首選帶蓋/具塞玻璃瓶，使用前應(yīng)對其進行滅菌。滅菌可采用干熱或濕熱兩種方式。干熱滅菌儀器采用電熱干燥箱，滅菌溫度要求在160℃以上保持至少2 h，濕熱滅菌儀器采用高壓滅菌鍋，壓力及溫度條件為121℃，保持30min。滅菌后至使用前應(yīng)保持瓶蓋的密封。從而避免因容器原因造成的樣品污染。使用過后的容器，如果樣品微生物濃度過大，應(yīng)進行滅活避免污染環(huán)境及危害人員。固體樣品如土壤/固廢采集的容器首選廣口玻璃瓶，使用前亦應(yīng)進行滅菌，采樣后應(yīng)用牛皮紙對瓶口進行包裹。

采樣器在采集樣品前亦應(yīng)進行消毒滅菌。滅菌方法同樣品容器的滅菌方法。不具備整套采集器滅菌的采樣器可選用75%乙醇對接觸樣品部位進行消毒滅菌。消毒滅菌后的采樣器應(yīng)存放于潔凈的專用包裝中帶至采樣現(xiàn)場。

3樣品的采集與運輸

樣品采集的時候要注意選擇具有代表性的樣品。在進行微生物監(jiān)測的時候要做好微生物采樣的規(guī)劃，選取好點位，保證采集樣品的代表性。為了保證樣品沒有受到外界及人為的污染，在選取樣品之后注意避免人體及其他污染源接觸，使用已消毒的采樣器進行采集。采集到的樣品應(yīng)在低溫（O～4℃）避光保存。樣品采集至送到實驗室分析應(yīng)不超過12 h。樣品在運輸過程中應(yīng)配備車載冰箱，保證運輸過程中的樣品不發(fā)生變異。

4微生物檢測方法的選擇及質(zhì)量控制

微生物檢測的方法一般有平板計數(shù)法、MPN法、濾膜法等。平板計數(shù)法適用于水、土壤中細菌或者真菌的菌落總數(shù)，或者空氣中浮游菌、沉降菌的檢驗。平板計數(shù)操作簡便，適用的樣品類型多，且易于后期菌落的分離純化，但檢出限較高，對于環(huán)境中微生物濃度較低的樣品無法檢出。MPN法是一種利用統(tǒng)計學(xué)原理定量檢測微生物濃度的方法，根據(jù)采用的介質(zhì)又可分為紙片法與多管發(fā)酵法。紙片法方便快速，但僅適用于水樣，且易受樣品的pH值和還原性物質(zhì)干擾，容易出現(xiàn)假陰假陽現(xiàn)象。多管發(fā)酵法適用樣品類型廣，常用于特定種群的微生物如大腸菌群等的檢驗，特別是低濃度的微生物檢測，其檢出限比平板計數(shù)法低，但對于濃度較高的樣品往往需要多倍稀釋，故需要根據(jù)樣品來源先進行經(jīng)驗上的預(yù)估，且對陽性反應(yīng)的管應(yīng)進行下一步的確認。濾膜法只適用于水中微生物的檢測，且要求水中懸浮物等雜質(zhì)不能太多，故一般用于飲用水、純化水及對于微生物有嚴格要求的水質(zhì)檢測，其優(yōu)點是檢出限低，檢測的樣品量大，結(jié)果代表性好。

樣品進入微生物實驗室應(yīng)通過傳遞窗，在傳遞窗中應(yīng)紫外消毒30min以上，人流物流要分開。人員進入微生物實驗室要嚴格執(zhí)行自身凈化程序：換鞋、更潔凈衣、戴口罩、戴手套、手消毒等;無菌室及室內(nèi)的儀器、設(shè)備、材料、工具使用紫外線照射30min或用75%乙醇溶液消毒。樣品拆封開蓋前要用酒精棉球?qū)Ψ饪谥車M行消毒，避免污染。檢測用的玻璃儀器如吸管、培養(yǎng)皿應(yīng)進行滅菌后使用，且吸管在微生物檢測過程中不得混淆使用;不同樣品，不同稀釋液應(yīng)使用不同的吸管，避免交叉污染。在操作時應(yīng)避免人及衣服接觸到培養(yǎng)基、稀釋液及樣品。檢測過程中應(yīng)于檢驗區(qū)域放置空白平皿用于檢測全過程的空氣沉降菌。每次實驗完后做好桌面、設(shè)備表面、地面的清潔衛(wèi)生，再用紫外燈照射滅菌30min;工作服、鞋帽、口罩應(yīng)定期更換滅菌。

每批樣品在檢驗時，應(yīng)同時做空白對照。空白不得有任何反應(yīng)，否則，該批次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測定。定期按照樣品同樣的檢驗方法進行陽性及陰性對照菌試驗，陽性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，陰性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測定。對于檢測結(jié)果陽性反應(yīng)不明顯，或者疑似假陽性的、假陰性的樣品，應(yīng)挑取典型菌落或培養(yǎng)液，進行下一步的培養(yǎng)確定。另外，可定期購買檢定機構(gòu)的微生物質(zhì)控樣品進行比對。對于實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制，還可以采用人員比對、不同方法比對的方式驗證結(jié)果的準確性。

5微生物實驗室的潔凈度控制

實驗室的布局與設(shè)計應(yīng)充分考慮到良好的微生物實驗室操作和實驗室安全的要求。實驗室布局設(shè)計的基本原則是既要最大可能防止微生物的污染，又要防止檢驗過程對環(huán)境和人員造成危害。一般對于環(huán)境微生物的檢測，其檢測室操作臺潔凈度應(yīng)該達到100級（即ISO 5級），背景潔凈度應(yīng)該達到1000級（即ISO7級）的要求。在使用前應(yīng)至少采用紫外消毒30min以上;使用后應(yīng)對操作臺及相關(guān)潔凈區(qū)域進行清潔并消毒。使用的消毒劑可采用75%乙醇，新潔爾滅溶液，84消毒液;并每月輪換使用，避免微生物出現(xiàn)耐藥性而滅菌效力下降。

日常工作中應(yīng)對微生物實驗室的環(huán)境進行監(jiān)測，確保微生物實驗室的環(huán)境潔凈度能達到要求，保證微生物檢驗結(jié)果的可靠性。監(jiān)測指標有懸浮粒子、沉降菌、高效過濾器完整性測試、風速及換氣次數(shù)等。監(jiān)測方法可參照GB/T 25915.1-2010、GB/T 25915.3-2010、GB/T16292-2010、GB/T16293-2010、GB/T 16294-2010中的方法進行監(jiān)測。

6培養(yǎng)基的質(zhì)量控制

為確保所用培養(yǎng)基質(zhì)量符合相關(guān)檢查的需要，應(yīng)對培養(yǎng)基的質(zhì)量進行質(zhì)量控制實驗。對每批購進的或自制的培養(yǎng)基，應(yīng)進行培養(yǎng)基適用性檢查。適用性檢查方法一般為使用檢定機構(gòu)制備的對照培養(yǎng)基，使用100cfu/mL左右的適宜標準菌液，用對照培養(yǎng)基和配制的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)計數(shù)，培養(yǎng)結(jié)果配制的培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基的比值應(yīng)在0.5～2.0的范圍內(nèi)，否則視為不合格。配制好的培養(yǎng)基應(yīng)保存于O～5℃的冰箱中，其保存期限可通過穩(wěn)定性試驗確定。

7結(jié)語

環(huán)境監(jiān)測是環(huán)境保護的重要組成部分，它既為了解、評價環(huán)境質(zhì)量狀況提供信息，也為制定各項管理制度、法律法規(guī)提供科學(xué)依據(jù)。加強環(huán)境監(jiān)測中的質(zhì)量控制，保證環(huán)境監(jiān)測數(shù)據(jù)的準確性與可靠性，是一項至關(guān)重要的工作。