基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討葛酮通絡(luò)膠囊緩解缺血性腦卒中機制

楊紅 張威 安太健 王慶峰

摘要：目的 ?采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討葛酮通絡(luò)膠囊緩解缺血性腦卒中（ICA）的機制。方法 ?依托DisGeNET數(shù)據(jù)庫構(gòu)建ICA背景網(wǎng)絡(luò)，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）及TCM Database檢索葛根中的黃酮類化合物，獲得其相應(yīng)靶點，并對ICA進行打靶處理，獲得作用靶點，進而構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，據(jù)此分析葛酮通絡(luò)膠囊緩解ICA的機制。結(jié)果 ?獲得葛根黃酮化合物9個，其對應(yīng)靶點321個，ICA靶點共393個。葛根的黃酮化合物共有48個為其藥物作用的直接靶點，平均節(jié)點度為30.8，核心蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中22個靶點的節(jié)點度大于平均節(jié)點度。葛酮通絡(luò)膠囊改善ICA的主要KEGG通路為血液流體及動脈粥樣硬化、核因子-κB、腫瘤壞死因子等，并廣泛參與調(diào)節(jié)血液代謝如調(diào)節(jié)血壓、調(diào)節(jié)脂代謝過程、調(diào)節(jié)細胞凋亡等生物過程。結(jié)論 ?本研究初步驗證了葛酮通絡(luò)膠囊緩解ICA的靶點及作用方式，可為進一步揭示其作用機制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：葛酮通絡(luò)膠囊;缺血性腦卒中;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子靶點;作用機制

中圖分類號：R277.733;R2-05 ???文獻標識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）12-0084-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.12.018 ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Discussion on Mechanism of Getong Tongluo?Capsules in Relieving Ischemic Stroke Based on Network Pharmacology

YANG Hong¹， ZHANG Wei¹， AN Taijian¹，?WANG Qingfeng²

1. Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110032， China; 2. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110032， China

Abstract：?Objective To explore the mechanism of Getong Tongluo Capsules in relieving ischemic stroke （ICA）?through network pharmacology. Methods The background network of ICA was constructed based on DisGeNET database， and the flavonoids in Puerariae Lobatae Radix?were retrieved by TCMSP and TCM database to obtain their corresponding targets. The ICA were targeted with the above targets， and the target of its action was obtained， and then a protein interaction network and a compound-target-path network were constructed. Finally， the mechanism of Getong Tongluo Capsules in alleviating ICA was analyzed. Results There were 9 flavonoids in Puerariae Lobatae Radix， with 321 corresponding targets， and 393 ICA targets. There were 48 flavonoids in Puerariae Lobatae Radix as the direct targets of drug action， with an average node degree of 30.8， while 22 targets were larger than the average node degree?in the core PPI network. The main KEGG pathways of Getong Tongluo Capsules in improving ICA symptoms were blood fluids and atherosclerosis， NF-κB and TNF. Getong Tongluo Capsules were more widely involved in regulating blood metabolism， such as blood pressure regulation， lipid metabolism and apoptosis. Conclusion The results of this study preliminarily validate the target and mode of Getong Tongluo?Capsules in alleviating ICA， and lay a foundation for further revealing its mechanism of action.

Keywords：Getong TongluoCapsules; ischemic stroke; network pharmacology; molecular targets; mechanism of action

缺血性腦卒中（ischemic cerebralvascular accident，ICA）是臨床常見的急性腦血管疾病。在ICA治療過程中，除溶栓、抗凝及神經(jīng)保護等藥物外，還可聯(lián)用中藥^[1-2]。已有研究表明，葛酮通絡(luò)膠囊用于治療腦卒中療效良好^[3-5]。葛酮通絡(luò)膠囊主要成分為葛根總黃酮，功效活血化瘀，用于缺血性中風(fēng)中經(jīng)絡(luò)恢復(fù)期瘀血痹阻脈絡(luò)證，癥見半身不遂、口舌歪斜、偏身麻木、語言不利、頭暈?zāi)垦！㈩i項強痛等。目前針對葛酮通絡(luò)膠囊的研究多集中于臨床，其機制研究相對較少。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建中藥成分-靶標-信號通路復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，分析葛酮通絡(luò)膠囊有效成分作用于ICA的主要靶點，以期闡明其分子調(diào)控機制。

1 ?資料與方法

1.1 ?藥物有效成分篩選

葛酮通絡(luò)膠囊的主要成分為葛根總黃酮提取物。通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），得到葛根的已知化合物，獲取其中的黃酮類化合物，即為葛酮通絡(luò)膠囊的有效成分。

1.2 ?口服生物利用度預(yù)測

口服生物利用度（OB）指藥物在人體循環(huán)系統(tǒng)的吸收情況，并以吸收、分布、代謝、排泄（ADME）藥代動力學(xué)參數(shù)評價藥物的口服吸收活性。本研究根據(jù)TCMSP中的OBioavail模型^[7]評價藥物的吸收特性，并基于此獲得葛酮通絡(luò)膠囊黃酮類成分的OB值。

1.3 ?藥物有效成分和疾病靶點收集

在Drugbank數(shù)據(jù)庫（http：//www.drugbank.ca）中找出葛酮通絡(luò)膠囊有效成分所作用的分子靶點。檢索DisGeNET數(shù)據(jù)庫（http：//www.disgenet.org），以“Ischemic Cerebrovascular Accident”（№.C0948008）為關(guān)鍵詞，獲得ICA調(diào)控的分子靶點。以String構(gòu)建上述分子靶點對應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫。

1.4 ?網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

采用Cytoscape3.7.1軟件，以ICA的String數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，構(gòu)建ICA調(diào)控的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，再以葛酮通絡(luò)膠囊有效成分作用的分子靶點對該網(wǎng)絡(luò)進行打靶處理，獲得其對應(yīng)的直接調(diào)控靶點及其所涉及的相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過Cytoscape3.7.1軟件網(wǎng)絡(luò)分析功能對該網(wǎng)絡(luò)進行拓撲學(xué)運算，獲得該藥物-靶標網(wǎng)絡(luò)的分布特性。為確定葛酮通絡(luò)膠囊有效成分對目標蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控作用，以藥物與疾病重疊靶點的String數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)構(gòu)建背景網(wǎng)絡(luò)，再引入藥物的化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)，獲得化合物-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。采用Cytoscape3.7.1軟件cluster maker2插件對網(wǎng)絡(luò)特性進行聚類分析，采用其clueGO插件對關(guān)鍵分子靶點的基因功能（GO）和相關(guān)通路進行富集分析。

2 ?方法與結(jié)果

2.1 ?藥物有效成分及其靶點

從TCMSP共獲取葛根的已知化合物18種，其中黃酮類化合物共9種，其OB值為11.52%～69.67%，類藥指數(shù)（DL）為0.19～0.78，見表1。在Drugbank數(shù)據(jù)庫中找出9個有效成分所作用的分子靶點共321個，經(jīng)降重處理，獲得葛酮通絡(luò)膠囊有效成分作用的分子靶點共190個。

2.2 ?藥物-疾病作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲得ICA調(diào)控的分子靶點共393個（Summary模式）。以葛酮通絡(luò)膠囊作用的分子靶點對ICA調(diào)控的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進行打靶，獲得重疊的分子靶點共48個。

進一步根據(jù)ICA蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)特征，獲得與直接靶點調(diào)控較為密切的間接靶點，所得網(wǎng)絡(luò)形態(tài)見圖1。根據(jù)該網(wǎng)絡(luò)的拓撲結(jié)構(gòu)可知，網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的節(jié)點共311個，對應(yīng)的邊共4755條，平均節(jié)點度為30.8，共有113個節(jié)點大于平均節(jié)點度。

以48個直接靶點對葛酮通絡(luò)膠囊的化合物-分子靶點背景網(wǎng)絡(luò)進行打靶處理，獲得藥物的化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖2。

可以看出，在已獲得的9個黃酮類化合物中，大豆苷-4，7-二葡糖苷（daidzein-4，7- diglucoside）無法直接對ICA的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)進行調(diào)控，故后續(xù)研究及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建中不引入大豆苷-4，7-二葡糖苷所涉及的調(diào)控靶點分子。

葛酮通絡(luò)膠囊有效成分對目標蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)聚類分析結(jié)果見圖3。

對該網(wǎng)絡(luò)的拓撲結(jié)構(gòu)（剔除化合物節(jié)點）分析可知，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點共311個，對應(yīng)530條邊，平均節(jié)點度為19.32。該網(wǎng)絡(luò)可以確定為葛酮通絡(luò)膠囊緩解ICA的核心蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。對圖3靶點分子的節(jié)點度進行排序，結(jié)果見圖4。48個靶點中，大于平均節(jié)點度的靶點共22個，分別為IL6、PTGS2、VEGFA、NOS3、PPARG、MMP9、TP53、CXCL8、IL1B、ESR1、ICAM1、VCAM1、MMP2、MAPK1、IGF1、KDR、F2、IL4、TGFB1、AGTR1、AR和SELP。可確定上述分子靶點是葛酮通絡(luò)膠囊緩解ICA的核心調(diào)控分子。

2.3 ?基于藥物作用靶點的功能預(yù)測

為進一步考察葛酮通絡(luò)膠囊緩解ICA的作用方式及效果，對獲得的22個關(guān)鍵分子靶點功能進行分析。經(jīng)clueGO插件分析，獲得葛酮通絡(luò)膠囊的富集功能，見圖5、圖6。去除其中與ICA無關(guān)的通路（如膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、前列腺癌等），取P≤0.01，獲得葛酮通絡(luò)膠囊緩解ICA的主要KEGG通路，包括血液流體及動脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis，F(xiàn)ssAs）、核因子-κB（NF-κB）、腫瘤壞死因子（TNF）及松弛素（Relaxin）等通路。取P≤0.000 1，獲得調(diào)控的相關(guān)生物過程（GO-BP），其可通過對關(guān)鍵分子靶點的調(diào)控，實現(xiàn)對血管平滑肌（regulation of blood vessel endothelial cell migration）、一氧化氮代謝（positive regulation of reactive oxygen species metabolic process）、生成血管內(nèi)皮生長因子（regulation of vascular endothelial growth factor production）等生物過程的調(diào)控。

3 ?討論

葛酮通絡(luò)膠囊于1995年收入《中華人民共和國藥典》，但針對該藥的研究相對落后，仍然以臨床療效^[8-9]或質(zhì)量標準^[10-11]為主，而對其機制研究不夠深入，極大限制了該藥進一步的臨床應(yīng)用。本研究依托TCMSP構(gòu)建該藥的化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)，再應(yīng)用DisGeNET數(shù)據(jù)庫構(gòu)建ICA的背景網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)打靶處理，確定了葛酮通絡(luò)膠囊的化合物-靶點-疾病靶點的相互作用關(guān)系，為考察藥物的治療機制提供參考。

由圖2可知，染料木黃酮、大豆苷元和葛根素為整個藥物的關(guān)鍵化合物，其節(jié)點度遠高于其他化合物，可推測上述3個化合物在藥物治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用。基于染料木黃酮、大豆苷元的OB值及DL值低于葛根素（見表1），可以確定，葛根素是葛酮通絡(luò)膠囊最重要的有效成分。研究表明，葛根素有良好的抗缺血再灌注的藥理活性，可有效改善腎臟、心臟及腦的缺血再灌注癥狀^[12-14]。另外，大豆苷元^[15]、染料木黃酮^[16]、芒柄花黃素^[17]等也被臨床及基礎(chǔ)研究顯示有較好的改善腦缺血再灌注的藥理學(xué)活性。因此，葛酮通絡(luò)膠囊緩解ICA是一個多成分、多靶點、多途徑的過程。

由圖4可知，葛酮通絡(luò)膠囊參與了ICA相關(guān)大量分子靶點的調(diào)控。而這些靶點在ICA的發(fā)病過程中介導(dǎo)不同的生物學(xué)功能。隨著腦缺血發(fā)生，小膠質(zhì)細胞活化，并激活其對應(yīng)經(jīng)典激活（M1）及選擇激活（M2）表型。其中，M1可激活NFKB通路，該通路上的白細胞介素（IL）-1及基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9開始釋放，加重腦部損傷^[18];IL-4則隨M2的細胞激活而產(chǎn)生，從而抑制炎癥反應(yīng)，保護腦組織^[19]。隨著腦部缺血，腦組織內(nèi)的星形膠質(zhì)細胞亦會直接釋放多種促炎癥因子，進而誘導(dǎo)一氧化氮合酶（NOS）過表達，促進反應(yīng)性膠質(zhì)增生和膠質(zhì)瘢痕形成^[20]。除直接調(diào)控腦組織的細胞活化外，葛酮通絡(luò)膠囊的分子靶點還包括細胞黏附分子（ICAM）及趨化因子所涉及的炎癥反應(yīng)。腦部缺血會上調(diào)ICAM表達，導(dǎo)致細胞間的黏附，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng);此時，內(nèi)皮細胞表面的選擇素-P及選擇素-E會募集血液中白細胞，并通過ICAM1結(jié)合于血管內(nèi)皮表面，再使其分泌的水解酶直接破壞組織損傷區(qū)的血管壁^[21]。腦部缺血也會上調(diào)趨化因子（CXC）的表達，維持炎癥反應(yīng)及組織損傷區(qū)的炎癥通路。Villa等^[22]研究顯示，通過對IL-8/CXCL8的抑制，腦部損傷面積顯著縮小，且腦部的炎癥反應(yīng)隨之減輕。ICA可直接改變腦組織的血腦屏障通透性，特別是損傷區(qū)域，由于ICAM及CXC的持續(xù)炎癥作用，血腦屏障的通透性增加會持續(xù)長達損傷后7 d，這也開啟了大量炎性細胞進入損傷區(qū)域的通道。因此，降低血腦屏障通透性可保護ICA帶來的腦組織損傷，葛酮通絡(luò)膠囊可通過對MMP的調(diào)控發(fā)揮該作用。MMP是腫瘤研究中的關(guān)鍵靶點分子， MMP過表達導(dǎo)致細胞外基質(zhì)不斷降解，增加血腦屏障通透性。以往研究顯示，MMP-9隨著ICA的發(fā)病而過表達，且與腦梗死面積、神經(jīng)功能缺損程度呈正相關(guān)^[23-24]。本研究顯示，除炎癥反應(yīng)外，葛酮通絡(luò)膠囊還可改善ICA的血管重構(gòu)，如調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及Relaxin信號通路上的靶點分子誘導(dǎo)內(nèi)皮型一氧化氮^[25]及VEGFA^[26]等。其生物過程包括：①調(diào)控血管平滑肌的增殖過程（IL-6、TSF1）;②調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的遷移（TGR、TGFB1）;③調(diào)節(jié)VEGF的產(chǎn)生（IL-1B、TGFB1）。

根據(jù)功能富集結(jié)果可知，葛酮通絡(luò)膠囊主要調(diào)控的KEGG通路包括FssAs、炎癥反應(yīng)（如NF-κB和TNF）、Relaxin信號通路等。通過對炎癥反應(yīng)的通路調(diào)控，改善ICA所致的血腦屏障破壞、腦水腫等炎癥浸潤;通過對FssAs、Relaxin通路調(diào)控，緩解ICA血管重構(gòu)所致的腦部缺氧去極化、氧自由基損傷及腦部細胞凋亡。GO-BP富集結(jié)果表明，葛酮通絡(luò)膠囊可有效調(diào)節(jié)血管平滑肌及氧代謝過程。對葛酮通絡(luò)膠囊的功能富集分析表明，可有效理清其緩解ICA的主要路徑及方式。葛酮通絡(luò)膠囊通過對靶點的調(diào)控，影響其對應(yīng)的表型/通路，從而緩解ICA。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對葛酮通絡(luò)膠囊多成分、多靶點、多途徑的復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系進行研究，結(jié)果初步驗證了葛酮通絡(luò)膠囊緩解ICA的相關(guān)機制，并為進一步深入探討其作用機制奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2019-02-18）

（修回日期：2019-03-15;編輯：陳靜）