四大產區商品莼菜多糖組成及抗氧化活性分析

李京凌，滕左，韓芳，袁婧，于杰,3*

1(西南大學 園藝園林學院，重慶,400715) 2(重慶市銅梁二中，重慶,402560) 3(南方山地園藝學教育部重點實驗室，重慶,400715)

莼菜(BraseniaschreberiJ.F.Gmel.)是莼菜科(Cabombaceae)多年生水生宿根草本，在我國重慶、云南、四川、湖南、湖北、浙江和江蘇等地均有分布[1]。莼菜含有豐富的微量元素、膳食纖維、多糖物質和多種人體必需氨基酸[2-4]，具有降血脂、抗氧化和調節免疫等功效[5-11]，應用前景廣闊[12-13]。莼菜幼葉的果膠中富含多糖，莼菜多糖的單糖組成成分及生物活性一直是莼菜的研究熱點。據KAKUTA等[14]、王倩[7]、張平等[15]分析研究，發現莼菜多糖含有半乳糖、巖藻糖、甘露糖等多種單糖成分，但具體單糖種類及含量在各報道中存在差異；周毅峰等[9]研究報道了莼菜多糖具有良好的抗氧化活性，但對抗氧化活性起作用的具體單糖物質目前仍缺乏系統的研究。

本研究采用苯酚-硫酸顯色法對不同產區莼菜總糖含量進行測定，利用高效液相色譜法檢測莼菜多糖成分及含量，采用DPPH、FRAP、ABTS法對莼菜多糖進行抗氧化活性測定，最后通過相關性分析探究對抗氧化活性有貢獻的具體單糖物質，旨在為我國莼菜資源研究提供更多的基礎數據，也為莼菜的生產加工及相關產品的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

本實驗以重慶石柱(SZ)、湖北利川(LC)、四川雷波(LB)、浙江西湖(XH)4個地區莼菜的嫩葉為材料。

石油醚、氯仿、正丁醇、三氟乙酸、苯酚、過氧化氫等試劑,成都科龍化工試劑廠。單糖標準品,美國Sigma公司(St Louis，Mo，USA)。

1.2 儀器與設備

Scientz-10N冷凍干燥機，寧波新芝凍干設備股份有限公司；721G可見光分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；Agilent1200高效液相色譜儀，南京利爾實驗儀器設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 莼菜多糖的提取

將各產區莼菜冷凍干燥，粉碎過40目篩獲得莼菜干粉，參考周毅峰[9,16-17]方法提取莼菜多糖。離心所得上清液中的蛋白質用Sevag法[18]除去，最后所得堿溶性及水溶性多糖溶液置于4 ℃冰箱保存[6]。

1.3.2 總糖含量測定

參考寧可[19]方法繪制標準曲線測總糖含量。

1.3.3 HPLC測定多糖組成及含量

參考符夢凡等[20]、欒麗杰等[21]柱前衍生化HPLC法略加修改。色譜條件：選用Thermo C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，柱溫25 ℃，流速為1.0 mL/min，進樣量10 μL，流動相為0.1 mol/L pH 7.0V(磷酸鹽緩沖溶液)∶V(乙腈)=82∶18的溶液，波長245 nm。

1.3.4 抗氧化能力測定

參考左龍亞[22]、張昭[23]的DPPH、ABTS和FRAP法檢測樣品的抗氧化能力。

1.3.5 統計學處理

實驗進行3次生物學重復，采用SPSS 19.0軟件進行單因素差異分析(one-way analysis of variance，ANOVA)及皮爾森相關性分析[24](pearson’s correlation analysis)，顯著性水平為0.05。莼菜多糖類物質抗氧綜合百分比(antioxidant percent comprehensine,APC)指數/%=(測定值/最大值)×100，APC綜合指數/%=Σ[(測定值)/(3×最大值)×100]。

2 結果與分析

2.1 四大產區莼菜總糖含量分析

以葡萄糖為標準品，繪制所得標準曲線(y=0.046x-0.000 9，R2=0.999 9)如圖1所示，在0～10 mg/mL范圍內線性關系良好。利用該標準曲線對不同產區莼菜的總糖含量進行分析，結果如圖2所示。

莼菜堿溶性及水溶性多糖含量在不同產區中均存在顯著性差異(P<0.05)。雷波莼菜堿溶性多糖含量最高，達到(10.150±0.236)mg/g(Mean±ED，下同)；利川莼菜水溶性多糖含量最高，為(7.360±0.190)mg/g。除利川莼菜外，其他3個產區莼菜中的堿溶性多糖含量均高于水溶性多糖。

受采摘季節及取材部位等因素影響[19]，莼菜總糖含量在各研究報道中存在一定差異[16,19,25]。本研究所測總糖含量相較其他報道偏低，除莼菜嫩葉可能存在多糖物質合成積累不足外，還可能是莼菜中含有相同濃度下吸光值較葡萄糖低的單糖組分，故以葡萄糖為標準曲線計算所得總糖含量偏低。在本研究中，雷波莼菜的總糖含量最高，為(15.470±0.348)mg/g，顯著高于含量最低的利川莼菜(14.500±0.179)mg/g(P<0.05)。莼菜多糖含量的地區差異除與生長狀況有關外，還與品種及產區生態條件密切相關[3]。

2.2 四大產區莼菜多糖的組成及含量分析

2.2.1 HPLC結果分析

將10種單糖標準品在245 nm波長下進行檢測，所得回歸方程如表1所示，相關性良好。圖形波峰明顯，對稱性良好，能夠進行各類單糖物質的檢測。圖3為部分樣品及標準品色譜圖。

2.2.2 多糖的組成及含量分析

據余昌均[25]研究報道，莼菜多糖中各單糖組分及所占比例為：半乳糖32%～40%、葡萄糖醛酸19%～29%、巖藻糖13%～16%、甘露糖10%～14%、鼠李糖6%～9%、木糖2%～7%、阿拉伯糖2%～3%和少量葡萄糖，共8種單糖組分。與余昌均[25]報道相比，王倩[7]、寧可[19]研究報道為7種單糖組分，均未檢測到葡萄糖醛酸，而崔杰等[26]同樣報道為7種單糖組分，未檢測到阿拉伯糖。

本研究以4大產區莼菜嫩葉為材料，分別測定莼菜堿溶性多糖和水溶性多糖的組分及含量，結果如表2所示。所測成分為半乳糖等10種單糖，各單糖在2類多糖中的含量存在差異。各產區莼菜的半乳糖質量分數在2類多糖中均為最高(36.05%～40.33%)，其次是巖藻糖(14.32%～16.68%)、甘露糖(11.60%～16.35%)和葡萄糖醛酸(6.85%～12.55%)，其他單糖組分為鼠李糖、木糖、阿拉伯糖，少量葡萄糖、半乳糖醛酸和核糖。其中，半乳糖醛酸和核糖均為首次報道，核糖可能因含量過低而在部分莼菜中未檢測出。以往的報道中，一般均認為半乳糖在莼菜多糖組分中含量最高，但其余單糖組分及所占比例在各報道中不盡相同。除半乳糖外，王倩[7]研究報道，其次應為鼠李糖、巖藻糖和木糖，而崔杰等[26]報道為巖藻糖、木糖和鼠李糖。本研究所測結果顯示半乳糖、巖藻糖、甘露糖和葡萄糖醛酸的含量位列前四，與余昌均[25]研究結果最為接近。莼菜不同部位提取的多糖中各單糖組分及含量存在明顯差異[19]。本研究所測甘露糖含量相比王倩[7]、崔杰等[26]報道偏高，葡萄糖醛酸含量相比余昌均[25]報道偏低，這除了與莼菜取材部位有關外，還可能是受提取溶劑的影響。在本研究中由于堿液浸提過程會對莼菜嫩葉細胞壁造成一定破壞，導致浸提液中的多糖種類及含量與水解法存在差異。

注：不帶*表示水溶性多糖，帶*表示堿溶性多糖，下同；ND表示未檢測出。

比較4大產區莼菜水溶性多糖中各單糖組分及含量，發現主要單糖組分中，甘露糖、巖藻糖在利川莼菜中含量最高，分別為16.35%、16.30%；半乳糖在石柱莼菜中含量最高(40.33%)，西湖莼菜中含量最低(36.38%)；葡萄糖醛酸在雷波莼菜中含量僅6.85%，遠低于其他產區；其余含量較低的單糖組分如葡萄糖、半乳糖醛酸的含量也存在一定差異。同樣比較不同產區莼菜堿溶性多糖中各單糖組分及含量，發現西湖莼菜中的半乳糖、甘露糖和葡萄糖醛酸含量均為4個產區中最低，而巖藻糖在雷波莼菜中含量最低，為14.44%。核糖在西湖莼菜中的含量則遠高于其他產區。莼菜對栽培條件要求較高，氣候、水質等環境條件對莼菜多糖物質的合成有較大影響[27]，這是各產區莼菜單糖含量產生差異的重要原因。

2.3 四大產區莼菜多糖抗氧化活性分析

2.3.1 莼菜多糖DPPH自由基清除能力比較

前人對于莼菜多糖抗氧化能力的研究主要集中在多糖類型和莼菜取材部位[9,19]，本研究分別提取4大產區莼菜的堿溶性多糖和水溶性多糖，比較不同產區莼菜2類多糖抗氧化能力的差異。如圖4所示，4大產區莼菜堿溶性多糖對DPPH自由基清除能力由強到弱為：雷波莼菜、石柱莼菜、利川莼菜、西湖莼菜。雷波莼菜清除率最高，清除率達(24.563±0.950)%，顯著高于其他3個產區(P<0.05)。四大產區莼菜水溶性多糖中，利川莼菜對DPPH自由基清除能力最強，清除率為(46.950±0.976)%；顯著高于石柱莼菜和西湖莼菜(P<0.05)，后2者分別為(40.990±0.528)%、(39.640±0.597)%，而雷波莼菜清除率最低，為(36.570±0.888)%。總體來說，莼菜的兩種類型多糖對DPPH自由基清除能力均存在地區間的差異，且水溶性多糖對DPPH自由基清除能力強于堿溶性多糖。

2.3.2 莼菜多糖FRAP抗氧化能力比較

由圖5可知：4大產區莼菜的2種類型多糖對FRAP鐵離子還原能力均存在顯著性差異(P<0.05)。

在莼菜堿溶性多糖中，對FRAP鐵離子抗氧化能力由強到弱依次為：雷波莼菜、石柱莼菜、西湖莼菜、利川莼菜，其FRAP還原值依次為(61.060±1.756)、(56.450±0.966)、(48.250±1.777)、(42.820±1.961)μmol/g。而在莼菜水溶性多糖中，對FRAP鐵離子抗氧化能力強弱順序為：利川莼菜>石柱莼菜>西湖莼菜>雷波莼菜；最高還原值(利川莼菜)與最低還原值(雷波莼菜)分別為(60.775±1.181)、(40.980±1.119)μmol/g。

2.3.3 莼菜多糖ABTS自由基清除能力比較

由圖6可知：在莼菜堿溶性多糖中，雷波莼菜ABTS自由基清除能力最強，為(48.690±1.782)%，顯著高于利川、石柱莼菜(P<0.05)，但與西湖莼菜差異不顯著。在莼菜水溶性多糖中，利川莼菜水溶性多糖對ABTS自由基清除能力最強，為(57.240±2.242)%；其次是雷波莼菜，為(52.620±1.256)%；石柱和西湖莼菜最弱，但均高于45%。總體來說，莼菜水溶性多糖對ABTS自由基清除能力強于堿溶性多糖，且存在產區間的差異。據周毅峰等[9]研究報道，莼菜水溶性多糖抗氧化能力強于堿溶性多糖，總抗氧化能力與多糖濃度密切相關，受水溶性多糖含量的影響更大。本研究針對不同產區莼菜的2類自由基清除實驗中，水溶性多糖抗氧化能力強于堿溶性多糖，這與周毅峰等[9]的研究結果基本一致。

2.3.4 四大產區莼菜多糖抗氧化活性綜合評價

3種抗氧化檢測方法所得不同莼菜及多糖類型的APC綜合性指數如表3所示，各類莼菜多糖的APC綜合性指數在51.88%～99.62%之間。在水溶性多糖中，綜合抗氧化力由強到弱依次為：利川莼菜、石柱莼菜、西湖莼菜、雷波莼菜；其中利川莼菜的綜合抗氧化能力最強，APC綜合性指數為99.62%，對DPPH自由基清除能力(APC指數100%)、ABTS自由基清除能力(APC指數100%)及對FRAP鐵離子還原能力(APC指數98.86%)均達到最大APC指數；雷波莼菜則最弱，APC綜合性指數為79.38%。

在堿溶性多糖中，綜合抗氧化能力強弱順序為：雷波莼菜、石柱莼菜、西湖莼菜、利川莼菜，APC綜合性指數分別為67.84%、61.73%、55.06%、51.88%。各產區莼菜2類多糖抗氧化能力強弱順序與其多糖的含量排序大致相同，這表明莼菜多糖的抗氧化活性與其含量密切相關。

綜合2種類型多糖抗氧化能力比較各產區商品莼菜的抗氧化活性，結果為利川莼菜>石柱莼菜>雷波莼菜>西湖莼菜，其APC綜合指數均值分別為75.75%、74.58%、73.61%、69.98%。以上數據表明，莼菜2類多糖均具有良好的抗氧化活性，這與周毅峰[9]、XIAO等[28]研究結果一致。但各產區莼菜2類多糖抗氧化能力存在顯著差異(P<0.05)，這種差異除與多糖含量有關外，可能還與其所含的有效作用因子有關。

2.4 莼菜多糖物質組分與抗氧化活性的相關性分析

進一步分析莼菜多糖及其物質組分與抗氧化活性之間的相關性，如表4、5所示。相關系數表明，莼菜2類多糖的濃度對DPPH自由基清除率、FRAP鐵離子還原能力均具有極顯著或顯著促進作用，相關系數在0.642～0.933之間。

注：**代表在0.01水平上顯著相關(雙尾)；*代表在0.05水平上顯著相關(雙尾)；下同。

莼菜水溶性多糖中，甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖和巖藻糖在內的5種單糖組分具有一定的抗氧化作用。其中，甘露糖、葡萄糖醛酸和巖藻糖對DPPH自由基清除和FRAP鐵離子還原均具有極顯著或顯著促進作用，相關系數在0.625～0.976之間。半乳糖僅對FRAP鐵離子還原能力有較大貢獻。而僅甘露糖和木糖對ABTS自由基清除具有極顯著促進作用。核糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖和阿拉伯糖5種單糖則在對DPPH自由基清除或FRAP鐵離子還原能力方面顯示出顯著或極顯著的負相關，表明水溶性多糖中的這幾類單糖對抗氧化活性具有抑制作用。

莼菜堿溶性多糖中，甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖和木糖在內的4種單糖組分具有一定的抗氧化作用，這4類單糖對DPPH自由基清除或FRAP鐵離子還原能力均具有極顯著的促進作用，相關系數在0.723～0.937之間。而僅木糖對ABTS自由基清除具有顯著促進作用。核糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖和巖藻糖在內的4種單糖在DPPH自由基清除及FRAP鐵離子還原能力方面顯示出顯著或極顯著的負相關，表明堿溶性多糖中這4類單糖對抗氧化活性具有抑制作用。

綜上，在2類多糖中，對抗氧化能力有貢獻的單糖種類除巖藻糖外均一致。巖藻糖在水溶性多糖中為極顯著正相關，而在堿溶性多糖中為極顯著負相關，它對抗氧化活性的作用機制還有待進一步研究。而在不同抗氧化測定方法中，起作用的單糖種類存在差異：ABTS法主要是甘露糖、木糖起作用，DPPH及FRAP法中甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖和木糖均有不同程度貢獻。

相關性分析數據表明，莼菜多糖的抗氧化活性與其含量及組成密切相關。甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖和木糖對抗氧化能力有顯著促進作用，是抗氧化活性的有效作用因子。而核糖、半乳糖醛酸和阿拉伯糖則與抗氧化能力呈顯著負相關，它們與鼠李糖、葡萄糖均不是抗氧化活性的貢獻者。西湖莼菜多糖綜合抗氧化能力較低，可能與其所含的甘露糖、半乳糖等有效作用因子相較其他產區偏低有關。

3 結論

由于莼菜對生長環境的要求較高，目前我國僅少部分地區種植莼菜。國內4大產區莼菜由于生長的環境條件不同，導致產生品質上的差異。本研究以國內四大產區商品莼菜為研究對象，分析了其總糖含量、多糖組成及含量，并分別提取四大產區莼菜的堿溶性多糖和水溶性多糖，比較不同產區莼菜2類多糖抗氧化能力的差異，探究各單糖組分對抗氧化活性的貢獻。與其他產區莼菜相比，利川莼菜多糖的綜合抗氧化能力更強。另外，各產區莼菜中，2類多糖均具有良好的抗氧化活性，但水溶性多糖抗氧化能力強于堿溶性多糖；而甘露糖等多種單糖組分對抗氧化活性具有顯著的貢獻作用。此結果對莼菜產區生態環境和栽培條件的研究有一定參考價值，同時，也為我國莼菜研究和莼菜多糖相關產品的開發利用提供理論依據。