微生物法合成N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的研究進展

牛騰飛，李江華，堵國成，劉龍，陳堅

(糖化學與生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc) 和氨基葡萄糖(glucosamine,GlcN)是重要的功能性單糖，是生物體內多糖透明質酸(hyaluronic acid,HA)、肝素、硫酸角質素等組成的重要單體之一，同時也是母乳寡糖、神經氨酸、殼寡糖合成的前體物質，可以維持生物體正常的生理功能。近年來，GlcNAc廣泛應用于食品、醫療保健、化妝品等領域，并且需求量逐年增加，市場應用前景廣闊。在歐美等發達國家，GlcNAc作為保健產品的重要組成成分，為人體提供必需的生物活性物質,因而被廣泛應用[1]。

GlcNAc存在于細菌、真菌、植物體和動物體中，廣泛分布于自然界中，同時也是幾丁質和殼聚糖的主要組成成分[2-3]。隨著GlcNAc市場需求的日益增加，傳統的生產方法面臨許多潛在問題[3-4]。例如，甲殼素原料供應短缺、環境污染、易產生過敏反應[5]。因此，生產更高效、更安全的G1cNAc是目前消費者需求的產品。近年來，由于微生物發酵法不受原料限制，生產效率高，污染小，而且不會產生過敏反應，越來越受到研究人員的關注。因此，構建高效生產GlcNAc的基因工程菌，能夠有效解決傳統生產方法所帶來的諸多問題，為社會生產發展帶來巨大的經濟效益[6]。

隨著GlcNAc市場需求的日益增加，構建高效生產GlcNAc的基因工程菌在工業化生產中表現出了巨大的潛力和吸引力。現如今國內外研究生產GlcNAc的基因工程菌主要為大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,B.subtilis)和谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum,C.glutamicum)。重組E.coli相對于甲殼素水解法具有巨大優勢及應用潛力。然而，由于E.coli不是食品安全級菌株；因此，適合于工業規模發酵生產的食品安全級生產菌株是微生物發酵法生產GlcNAc的理想菌株。許多通常被認為安全的微生物菌株己被鑒定，而且已經利用這些菌株實現了許多重要營養制品的生產[7]。C.glutamicum和B.subtilis的發酵工藝成熟、遺傳背景清晰、基因操作技術成熟并且不易受噬菌體污染，作為食品安全級工業生產菌株，被廣泛應用于發酵工業以生產氨基酸、透明質酸(hyaluronic acid,HA)、核黃素等各種化合物[8-11]。本文主要論述了產GlcNAc及其衍生物透明質酸和乙酰神經氨酸工程菌的構建中應用的代謝途徑改造與調控相關的代謝改造策略，并展望其重點的研究方向和存在的問題，以期為工業化發酵生產GlcNAc及廣泛應用提供支持。

1 GlcNAc合成途徑的構建

N-乙酰氨基葡萄糖合成途徑中2個關鍵的基因是氨基葡萄糖合成酶(glucosamine synthase,GlmS)基因和異源GlcN-6-磷酸乙酰轉移酶基因(GNA1)。由于E.coli、C.glutamicum和B.subtilis中都不存在GNA1基因，因此，構建完整的GlcNAc合成通路是合成目的產物的首要問題。2005年DENG等[12]在大腸桿菌中過表達異源GNA1，以葡萄糖為碳源合成GlcNAc。2012年，陳鑫等[13]通過共表達glmS和GNA1，構建了有效生產GlcN和GlcNAc的重組大腸桿菌。丁振中等[14]將pET24(a)-glmS-gna1表達載體轉化入大腸桿菌，GlcNAc發酵產量達到了31.2 g/L。

LIU等[15]選取了1株食品安全生產菌株B.subtilis作為出發菌株，將基因glmS和GNA1共表達并控制2個基因的不同表達強度以增強GlcNAc的合成，使GlcNAc的產量由1.83 g/L提高至4.55 g/L。由于在B.subtilis中，GlmS的表達受到由glmS核酶介導的反饋抑制[16-17]，從而限制關鍵前體物質GlcN6P的積累，因此，glmS核酶的反饋抑制是限制GlcNAc合成的限速步驟，所以解除glmS核酶的反饋抑制是積累GlcN6P的有效策略。NIU等通過敲除glmS核酶，同時在此位置整合一段終止子和強啟動子序列，已達到增強glmS基因的表達，從而有效解除核酶反饋抑制，使GlcNAc的產量明顯增加。

王雅婷等[18]選取谷氨酸生產菌株C.glutamicumATCC13032作為出發菌株，表達關鍵酶GlmS和GNA1，增強GlcNAc的合成途徑，實現以葡萄糖為碳源生產GlcNAc。

2 阻斷GlcNAc降解途徑

有效阻斷代謝產物的降解是代謝工程中一種有效積累目的產物的方法。將代謝產物有效分泌到細胞外,減少或阻斷代謝產物從胞外進入到細胞內,敲除代謝產物的降解途徑都可以有效減少代謝產物的降解。2005年DENG等[12]敲除nagBACD操縱子和乙酰氨糖轉運基因nagE，以阻斷GlcN向胞內運輸并降解，使GlcN產量達到了17 g/L。2012年，陳鑫等[13]敲除大腸桿菌中nagE與甘露糖磷酸轉運編碼基因manX，GlcN產量達到了最大值4.82 g/L，同時GlcNAc產量達到118.78 g/L。該結果表明，敲除氨糖的轉運編碼基因nagE和manX可有效降低胞外的GlcN與GlcNAc向胞內轉運，減少氨糖在胞內的代謝降解，可有效提高GlcN與GlcNAc在發酵液中的積累量。

在B.subtilis中存在氨糖的轉運途徑和降解途徑，LIU等[15]通過敲除GlcNAc專一性磷酸轉運編碼基因nagP,降低了GlcNAc向胞內的運輸，進一步敲除GlcNAc-6-P脫乙酰酶nagA、GlcN-6-P脫氨酶gamA和nagB，從而阻斷了前體物質GlcNAc-6-P和GlcN-6-P在胞內的降解，有效阻斷了GlcNAc在細胞內降解。在3 L發酵罐，經過補料分批發酵，G1cNAc產量達到5.19 g/L。C.glutamicum中同樣存在GlcNAc的降解途徑，王雅婷等[18]通過敲除nagAB使得構建的工程菌glmS-gna1-C.g-ΔnagAB在250 mL搖瓶發酵體系中GlcNAc產量達到1.43 g/L左右。

3 阻斷副產物積累

副產物的積累一直是工業化發酵生產中面臨的問題，由于副產物的產生，不僅降低了底物轉化成產物的轉化率，而且還為產物的分離帶來更復雜的工序和投資成本，所以消除副產物的積累，不僅能夠有效增加底物轉化率，同時能夠減少工業化生產中的加工工序，所以消除副產物的積累同樣是代謝工程改造中的一種重要策略。大腸桿菌的發酵中最常見的副產物是乙酸，陳鑫等[13]通過改變葡萄糖的吸收速率，ptsG缺陷的重組菌株經過發酵乙酸的積累量降低了71%，同時，GlcN和GlcNAc的總產量增加65.4%，達到128.75 g/L。

B.subtilis在穩定期能夠形成芽孢，相比于其他芽孢桿菌，維持較高代謝水平，降低了產物合成效率[19]。因此，工業生產B.subtilis需要阻斷芽孢產生[19-20]。LIU等[21]通過敲除spo0A和sigE阻斷了芽孢形成。此外，通過敲除編碼細胞色素的基因以減少維持代謝。在3 L發酵罐中GlcNAc的產量提高到了20.58 g/L。在搖瓶發酵中，乳酸和乙酸質量濃度分別達到4.1和3.3 g/L，這不僅抑制細胞生長，同時還降低了GlcNAc轉化效率。為促進GlcNAc合成，敲除乳酸脫氫酶編碼基因ldh和乙酰磷酸酶編碼基因pta阻斷乳酸和乙酸的合成，GlcNAc產量進一步提高44.9%，達到3.55 g/L。GlcNAc對底物葡萄糖的得率達到0.09 g/g，比未敲除ldh和pta前提高了50%[7]。然而發酵中另一副產物乙偶姻的質量濃度達到16.7 g/L，MA等[22]通過敲除乙偶姻合成相關基因alsR、alsS、alsD，阻斷了副產物乙偶姻的積累，在3 L生物反應器中GlcNAc的產量達到48.9 g/L，葡萄糖產率提高至0.32 g/L。

王雅婷等[18]將C.glutamicum的ldh敲掉，使得glmS-gan1-C.g-ΔnagABΔldh生產GlcNAc能力達到2.23 g/L，副產物乳酸濃度幾乎為0。但是對于谷氨酸棒桿菌，由于其是氨基酸生產菌，所以其副產物中可能會含有大量的氨基酸。因此，嘗試調控氨基酸的代謝以獲得更高的產率。

4 代謝網絡調控提高GlcNAc的積累

代謝工程通過對底盤微生物進行遺傳改造，通過調控內源基因的表達和引入異源途徑，通常會導致代謝途徑通量不平衡，引起中間代謝物過量積累，從而抑制胞內代謝活動，降低菌體的生理活性和發酵性能[23]。因此，解決代謝失衡問題，可以有效改善微生物細胞生長狀況、代謝物產量和產率。

B.subtilis中GlcNAc代謝網絡可以分為GlcNAc合成模塊、中心代謝模塊(6-磷酸果糖激酶Pfk是該模塊關鍵酶)和肽聚糖合成模塊(磷酸氨基葡萄糖變位酶GlmM是該模塊關鍵酶) (圖1)，而中心代謝模塊和肽聚糖合成模塊是GlcNAc合成的競爭模塊。要實現GlcNAc的高效合成，需要在強化GlcNAc合成的同時弱化中心代謝和肽聚糖合成模塊，而由于中心代謝和肽聚糖合成模塊是細胞生長所必須的，只能進行弱化表達而不能完全敲除。LIU等[7]通過利用反義調節RNA對3個代謝模塊的關鍵節點基因pfk和glmM進行優化組裝調控，經過發酵GlcNAc產量由3.55 g/L提高到8.30 g/L，通過這種補料分批發酵方式，GlcNAc產量達到了31.65 g/L。

通過對代謝節點的調控可以實現代謝流量的分流作用，從而能夠使得不同代謝途徑之間重新分配代謝流量。有效分配代謝流量可以平衡代謝途徑，從而提高代謝產物的產率。因此，開發潛在的代謝調控工具是代謝工程的重要基礎。NIU等[24]使用glmS核糖開關作為調控工具，因其具有動態響應胞內GlcN-6-P的濃度改變自身活性，從而能夠調控下游基因表達這一特性，利用glmS核糖開關分別調控pfk和glmM的表達，同時glmS核酶突變體M9調控pgi(磷酸葡萄糖異構酶基因)的表達(圖1)，胞內積累的GlcN-6-P作為信號分子，通過glmS核酶介導調控3個代謝節點關鍵基因的表達，當3個位點協同作用，才能有效分配代謝途徑之間的代謝流量，最終使得GlcNAc的產量達到了16.60 g/L，且無副產物乙偶姻的積累。WU等[25]開發了CRISPRi技術調控3個關鍵基因pfk、glmM、zwf，并通過進一步優化sgRNA的抑制能力，最終GlcNAc的產量達到20.5 g/L，得率為0.46 g/g(葡萄糖)，在3 L生物反應器中GlcNAc產量達到103.1 g/L，這表明平衡代謝途徑可以有效提高代謝物的產量和得率。

因此，解決代謝失衡問題，是代謝工程中的難題，隨著代謝工程技術的發展，不同代謝工程調控元件被加以設計，改造和組裝以實現平衡代謝途徑，重新分配代謝流量，調控重組菌適應性進化強度及途徑酶的定向進化等。最近新開發的用于代謝調控工程菌的調控元件有轉錄因子，同時還包括合成啟動子、動態響應啟動子、合成RNA及蛋白降解元件等[26-30]。

5 N-乙酰氨基葡萄糖衍生物的代謝合成

透明質酸(HA)是以β-1-3N-乙酰氨基葡萄糖和β-1-4葡萄糖醛酸(GlcA)為二糖重復單元的線性聚合物[31]。在人體內，臍帶、滑液、眼睛玻璃體液中含有大量的HA。因其具有顯著的流變性、黏彈性和吸濕性屬性，除廣泛應用在許多化妝品中，也被廣泛用于眼病、風濕病和皮膚病等的治療中[32]。WINDER等[33]在B.subtilis中表達來源于嗜熱鏈球菌的透明質酸合酶(hasA)，成功合成了1 MDa分子質量的HA。IZAWA等[34]在嗜熱鏈球菌中表達透明質酸合酶(hasA)和尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶基因(hasB)，使得HA的產量提高6倍達到1.2 g/L。JIA等[35]在B.subtilis中表達來源于Pasteurellamultocida中的HA合成酶基因和前體供應基因，合成分子質量為4.5 MDa的HA，產量達到6.8 g/L。并指出通過采用不同的策略能夠控制分子質量在8 kDa～5.4 MDa。2014年，JEONG等[36]在畢赤酵母中表達來源于X.laevis中的xhasA、xhasB和內源的hasC、hasD、hasE，合成分子質量為1.2 MDa的HA，并通過控制基因的表達強度，獲得不同分子質量的HA，最終在1 L發酵罐中HA的產量達到0.8～1.7 g/L。CHENG等[37]在C.glutamicum中表達hasA和相關內源HA合成基因，進一步通過培養條件的優化，使得在5 L發酵罐中HA產量達到8.3 g/L，產率為0.24 g/(L·h)，得率為0.22 g/g。CHENG等[38]進一步通過調控HA代謝合成途徑，比較不同操縱子組合對HA生產的影響，最終確定HasAB和HasABC是最有效的組合，同時阻斷乳酸的積累，最后在5 L發酵罐中HA產量達到21.6 g/L。CHENG等[39]基于基因組代謝模型iCW773，利用OptForceMUST算法進行代謝流平衡分析，確定改造靶點，利用系統設計和代謝改造，減弱糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑和丙酮酸降解途徑的代謝流量，其中所使用的策略包括：啟動子PdapB控制hasB的表達、反義RNA減弱fba、zwf的表達、刪除乳酸和乙酰合成途徑，最終使得HA產量達到28.7 g/L。這是目前為止報道的最高產量。因此，結合模型技術的系統生物學方法，能夠更加綜合與精確的理解細胞的生理狀態，擴大代謝工程的改造范圍，有效解決代謝瓶頸問題，為實現工業化生產提供理論基礎。

N-乙酰神經氨酸(NeuAc)在細胞中通常存在于細胞膜表面的糖蛋白和糖脂的末端，在細胞識別和信號傳遞中起重要作用[40]。膳食中添加NeuAc可以促進嬰兒大腦的發育，維持老年人的大腦功能和大腦健康[41]。已報到一些NeuAc的衍生物被用作納米載體的穩定劑用于癌癥靶向和治療[42]。因此，NeuAc具有潛在的食用和制藥應用價值，需要大規模生產NeuAc。ISHIKAWA等[43]最初采用全細胞催化合成NeuAc，但是操作復雜、產率低；為了高效合成NeuAc，利用E.coli過表達slr1975、neuB兩個基因，NeuAc產量達到25 g/L；進一步利用大腸桿菌高密度發酵，在添加120 g/L GlcNAc條件下，反應22 h NeuAc產量達到53 g/L。KANG等[44]在E.coli中設計了NeuAc的合成途徑，通過引入外源基因GNA1和乙酰氨基葡萄糖異構酶基因(slr1975)構建完整的合成途徑。進一步通過氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的去抑制，刪除GlcN-6-P分解代謝基因nagB，增強GlcNAc的積累；刪除ManNAc分解代謝基因manK、nanE，增加ManNAc的積累；刪除丙酮酸分解代謝基因ldhA、poxB、ackA，促進丙酮酸積累；刪除NeuAc輸入基因nanT，減少NeuAc的降解；以葡萄糖為碳源進行分批發酵，NeuAc的產量達到7.85 g/L。YAN等[45]利用幾丁質降解細菌Serratiamarcescens直接利用幾丁質合成NeuAc。首先共表達合成途徑關鍵基因slr1975、nanA。進一步利用RNASeq數據篩選不同強度的啟動子對這2個關鍵基因進行優化組合，并將催化可逆反應的nanA替換成不可逆的neuB基因；最終工程菌可利用20 g/L GlcNAc合成0.48 g/L NeuAc，利用5 g/L幾丁質合成0.3 g/L的NeuAc。ZHANG等[46]構建食品安全生產菌株B.subtilis合成NeuAc。首先通過過表達合成途徑關鍵酶GNA1、AGE、NeuB，形成完整的NeuAc重頭合成途徑，NeuAc產量達到0.33 g/L；進一步通過添加葡萄糖和蘋果酸平衡GlcNAc合成模塊和PEP供應模塊，使得NeuAc產量達到1.65 g/L；繼續阻斷糖酵解途徑、引入ED途徑、過表達蘋果酸酶YtsJ以平衡NeuAc生產與細胞生長之間的碳流量；最終NeuAc的產量達到2.18 g/L，為進一步構建工業化生產NeuAc菌株奠定基礎。

6 結論

GlcNAc作為一種在食品、醫療、化妝品領域應用廣泛的功能性單糖，同時也是許多功能性多糖和寡糖重要組成部分，越來越受到人們的關注。利用生物法制備GlcNAc是具有良好應用前景的GlcNAc生產新方法。目前，微生物法合成GlcNAc除了通過傳統的基因敲除和基因調控，還可以通過發掘潛在的代謝網絡調控工具進行調控。研究表明，有效的代謝網絡調控工具可以在代謝流的重新分配中起著重要作用，同時也是提高代謝物產量和產率的最佳選擇。目前的代謝工程中，對有效調控工具的發掘也將是代謝工程發展的一個重要環節。然而在生物體內，GlcNAc是通過前體物質GlcNAc-6-P經過磷酸酶催化發生去磷酸化作用而生成，大量積累的GlcNAc-6-P對細胞產生一定的毒性，所以，磷酸糖的去磷酸化反應也是GlcNAc合成的一步關鍵反應。目前只有來源于E.coli的HAD磷酸酶YqaB對GlcNAc-6-P具有水解去磷酸化作用，并沒有其他菌體來源的磷酸酶被報道。由于磷酸糖過量積累對細胞產生毒性作用，因此，進一步解析GlcNAc-6-P的分泌途徑，強化GlcNAc-6-P的去磷酸化作用，對GlcNAc的合成將會有促進作用。總的來說，要充分利用傳統的發酵工程手段，以及從基因工程的角度對工程菌株進行合理的優化和改造，以得到更高產量的符合工業化應用的GlcNAc生產菌株。