氣相色譜-正化學源-串聯三重四極桿質譜法測定面包中氨基甲酸乙酯

黃敏興，高裕鋒，甄振鵬，李碩聰，龐揚海，王小鵬，余構彬

(廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業研究所)，廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，國家糖業質量監督檢驗中心，中國輕工業甘蔗制糖工程技術研究中心，廣東 廣州，510316)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbonate,EC)是食品在發酵工藝中形成的天然副產物，主要存在于面包、酸奶、釀造醬油、食醋、豆豉等發酵食品中[1]。由于發酵食品中基本含有氨甲酰類物質，該類物質發生醇解反應時則生成氨基甲酸乙酯[2-3]。研究表明，氨基甲酸乙酯可誘發體細胞染色體改性，致使基因突變[4-8]；同時氨基甲酸乙酯屬于多位點致癌物質，若長期攝入，可誘發多系列癌癥，如肝癌、肺癌、淋巴癌、皮膚癌等[9-12]。2007年，氨基甲酸乙酯的致癌等級被確認為2A級[13]。因此為監測面包中氨基甲酸乙酯含量，開發快速、高效、穩定、靈敏度高的面包中氨基甲酸乙酯含量檢測方法具有重要意義。

目前氨基甲酸乙酯的檢測方法主要有氣相色譜法[14-15]、氣相色譜質譜法(gas chromatograph-mass spectrometry,GC-MS)[16-19]、液相色譜串聯質譜法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,HPLC-MS/MS)[20]、氣相色譜串聯質譜法(gas chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,GC-MS/MS)[21]等。由于面包基質較為復雜，富含蛋白質、油脂等，氨基甲酸乙酯本身分子量小，單一色譜法靈敏度相對較低、定性功能較差，易受雜質干擾，若發現陽性樣品還需色譜-質譜聯用技術進行確認。GC-MS法是目前最常用的檢測方法，國家標準也采用該方法實現對食品中氨基甲酸乙酯的測定，但是該方法基質干擾大、選擇性較差[16-19]；GC-MS/MS法通過采集離子對的方式，較GC-MS法選擇性顯著增強，靈敏度較高[21]。常見的GC-MS和GC-MS/MS離子源有化學電離源(chemical ionization,CI)和電子轟擊源(electron ionization,EI)2種，CI源靈敏度更高、選擇性更強，而且受柱流失和基質成分影響低，定性定量分析優勢更為明顯[22-24]。本文擬采用GC-MS/MS法結合正化學電離源(positive chemical ionization,PCI)模式，建立面包中氨基甲酸乙酯含量的GC-PCI-MS/MS測定方法，提升目標物檢測選擇特異性和靈敏度，為面包中痕量氨基甲酸乙酯的準確檢測提供有利的技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基甲酸乙酯標準品(純度≥99.0%)，德國Dr.Ehrenstorfer公司；D5-氨基甲酸乙酯標準品(純度≥99.5%)，德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙酸鉛(分析純)，廣州化學試劑廠；石油醚、乙醇、乙酸乙酯(色譜純)、有機相濾膜(0.22 μm)，彼西絡(廣州)科技有限公司；實驗室用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

氣相色譜-正化學源-串聯質譜儀(7890B氣相色譜儀配7000D質譜儀)，美國安捷倫公司；VT-WAX色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，廣州太瑋科技有限公司；Vortex-Genie 2旋渦混勻器，奧然科技有限公司；冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；Cleanert EC堿性硅藻土固相萃取柱，天津博納艾杰爾科技有限公司；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗條件

1.3.1 色譜條件

進樣口溫度：230 ℃；載氣：高純氦氣(99.999%)；碰撞氣：高純氮氣(99.999%)；柱流量：1.0 mL/min；進樣方式：不分流進樣；進樣量：1 μL。升溫程序：起始溫度50 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升至170 ℃，再以30 ℃/min升至240 ℃，保持3 min。

1.3.2 質譜條件

離子源：正化學源；電離方式：化學電離；離子源溫度：300 ℃；檢測方式：質譜多反應檢測(multiple realtion monitoring,MRM)模式；色譜-質譜連接口溫度：250 ℃；定性、定量離子對、碰撞能量等參數見表1。

注：“*”表示定量離子。

1.4 試驗步驟

1.4.1 標準溶液配制

準確稱取10.0 mg D5-氨基甲酸乙酯標準物質，用甲醇定容至10 mL，得到1 000 μg/mL的D5-氨基甲酸乙酯儲備液，再逐級稀釋至1 μg/mL標準中間液。準確稱取10.0 mg氨基甲酸乙酯標準物質，用甲醇定容至10 mL，得到1 000 μg/mL的氨基甲酸乙酯儲備液，再逐級稀釋至1 μg/mL標準中間液。分別準確吸取一定量氨基甲酸乙酯標準中間液，加入10 μL D5-氨基甲酸乙酯標準中間液，用甲醇定容至1.0 mL，得到0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的標準工作液。

1.4.2 樣品前處理

將面包剪碎，-20 ℃密封冷凍2 h，取出后迅速破碎均勻，準確稱取1.0 g樣品于15 mL離心管中，加入25 μL D5-氨基甲酸乙酯標準中間液(1 μg/mL)，然后加入10 mL 10 g/100 mL乙酸鉛溶液，渦旋，超聲10 min，離心，取4 mL上清液于Cleanert EC堿性硅藻土固相萃取柱中，在真空條件下，使樣品滲入固相萃取柱中，靜置10 min；用10 mL正己烷淋洗后，用20 mLV(乙酸乙酯)∶V(乙醚)=1∶10溶液洗脫，收集洗脫液，經無水Na2SO4除水后，氮吹濃縮至約0.5 mL，用甲醇定容至1 mL，上機，待測。

2 結果與討論

2.1 色譜條件優化

實驗比較了非極性柱VT-5MS、中等極性柱VT-35MS和極性柱VT-WAX對目標分析物的分離效果。氨基甲酸乙酯具有較強極性，導致其在非極性柱VT-5MS和中等極性柱VT-35MS上分離效果不佳以及峰型較差；而在VT-WAX色譜柱上獲得較好的分離度和峰型。

2.2 質譜條件優化

2.2.1 質譜離子源選擇

由于氨基甲酸乙酯的相對分子質量較小(89)，使用EI源進行檢測時，特征離子碎片不明顯，受背景干擾較為嚴重，靈敏度較低。CI源是一種軟化學電離源，選擇特異性強，能夠獲得準確的分子離子，離子碎片較少，相對EI源具有選擇性強、靈敏度高、背景干擾小的特點。由于氨基甲酸乙酯具有堿性和親核的特性，可用PCI源進行檢測。實驗比較了面包基質加標樣品(氨基甲酸乙酯、D5-氨基甲酸乙酯的質量濃度分別為10 μg/L、10 μg/L)在相同條件下，正化學源結合三重四極桿模式(positive chemical ionization-mass spectrometh/mass spectrometry,PCI-MS/MS)與硬電離源結合三重四極桿模式(electron ionization-mass spectrometry/mass spectrometry,EI-MS/MS)對氨基甲酸乙酯的檢測效果，見圖1。由圖1可得，在選擇PCI-MS/MS進行檢測時，氨基甲酸乙酯響應更好，同時背景基線更低、雜峰干擾更少，因此本實驗采用PCI源，在PCI-MS/MS模式下，以甲烷為反應氣對氨基甲酸乙酯進行分析。

2.2.2 質譜參數優化

在正化學電離源檢測模式下對氨基甲酸乙酯及D5-氨基甲酸乙酯進行全掃描分析，在質譜圖中選擇豐度較高、質荷比較大的離子作為母離子；設定5～40 eV(每5 eV一個間隔)的碰撞能，對選定的母離子進行產物離子掃描，根據產物離子質譜圖，選擇離子強度大的作為定量離子，離子強度次之的為定性離子，具體質譜參數見表1。圖2為使用優化后條件采集氨基甲酸乙酯和D5-氨基甲酸乙酯混合標準溶液的MRM色譜圖。

2.3 前處理條件優化

2.3.1 提取條件優化

面包含油脂及蛋白質較多，經過破碎均勻后，用溶劑提取時易產生溶脹現象，形成黏稠狀勻漿。若在提取過程中不進行蛋白沉淀，易導致提取不完全，凈化柱被堵塞，即使內標校正亦會出現回收率不穩定及偏低等情況。一般情況下，需要先用沉淀劑進行蛋白沉淀，再用提取溶劑進行提取，但過程相對繁瑣且易導致目標物損失。氨基甲酸乙酯具有較強極性，易溶于水，因此實驗可采用含蛋白沉淀劑的水溶液進行提取。乙酸鉛是典型的蛋白沉淀劑，在陰性面包樣品中添加氨基甲酸乙酯0.025 μg，比較10 mL的1、2、5、10、15、20 g/100 mL乙酸鉛水溶液作為提取溶劑的提取效果，平行試驗6次，以氨基甲酸乙酯平均峰面積指示提取效果(定量離子對61.9/44.0峰面積計)，結果見圖3。

結果表明，當乙酸鉛質量濃度≥10 g/100 mL時,氨基甲酸乙酯峰面積趨于平緩，因此選用10 g/100 mL乙酸鉛溶液進行提取。

2.3.2 凈化條件優化

面包含脂質、蛋白質、維生素、膳食纖維等物質，在提取過程中易形成共提取效應，干擾目標物檢測。同時，氨基甲酸乙酯本身分子量較小，形成的離子質荷比較小，易受雜質離子干擾。實驗比較了Cleanert EC堿性硅藻土固相萃取柱和佛羅里硅土柱對樣品提取液的凈化效果。結果發現，弗羅里硅土柱吸附氨基甲酸乙酯的能力較差，回收率不佳，主要體現在目標物損失大，理論加標濃度在儀器上檢測信號較低；而Cleanert EC堿性硅藻土固相萃取柱對氨基甲酸乙酯有很強的吸附能力，淋洗雜質后，反向洗脫目標物質，能夠得到較好回收率，氨基甲酸乙酯在儀器上的絕對響應更高，回收率在90%左右，因此選擇Cleanert EC堿性硅藻土固相萃取柱。

2.4 方法的線性范圍、檢出限和定量限

經氣相色譜-正化學源-串聯三重四極桿質譜儀，以選擇離子對監測模式進行分析測定，以氨基甲酸乙酯質量濃度為橫坐標(X)，特征離子對的相對峰面積(D5-氨基甲酸乙酯為內標校正)為縱坐標(Y)，作線性回歸，繪制標準曲線。氨基甲酸乙酯在0.5～50.0 μg/L范圍內相關系數為0.999 5。方法檢出限以空白面包基質稀釋標準曲線上的最低濃度出峰時，取信噪比S/N=3計算得出。定量限以空白面包基質稀釋標準曲線上的最低濃度出峰時，取信噪比S/N=10計算得到。氨基甲酸乙酯線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限(limit of determination,LOD)、定量限(limit of quantitation,LOQ)詳見表2。

2.5 方法回收率和精密度

以面包陰性樣品為空白，分別添加2.0、10.0、50.0 μg/kg三個不同水平的氨基甲酸乙酯標準溶液，同時加入25 μL 1 μg/mL的D5-氨基甲酸乙酯標準中間液，按照1.4.2進行樣品前處理，經GC-PCI-MS/MS分析。每個加標濃度水平1 d內平行測定6次，連續測定3 d，以當天配制的標準曲線計算加標樣品的濃度，并計算回收率和日內日間精密度(relative standard deviation,RSD)，結果見表3。

從表3可得出，面包中氨基甲酸乙酯的回收率在89.3%～95.6%之間，日內RSD在1.3%～4.6%之間，日間RSD在4.5%～9.9%之間，表明該方法的準確度高，穩定性好，通用性較強。

2.6 實際樣品測定

應用本方法測定了30批次面包(編號為1～30)中的氨基甲酸乙酯含量。30批次面包中有26批次檢出氨基甲酸乙酯，檢出率86.7%，數值范圍在0.65～92.23 μg/kg之間，其中有檢出，但數值低于1 μg/kg的樣品有4批次，說明該方法適用于氨基甲酸乙酯痕量分析，具體結果見表4。

注：ND表示未檢測到。

3 結論

本文比較了不同質量濃度乙酸鉛溶液對面包基質的蛋白沉淀效果及氨基甲酸乙酯提取效果，當乙酸鉛質量濃度達到10 g/100 mL時即可達到較好的蛋白沉淀效果及氨基甲酸乙酯提取效果；同時比較了氨基甲酸乙酯在PCI和EI兩種離子源檢測條件下的靈敏度及基質干擾情況，其中氨基甲酸乙酯在PCI源檢測條件下靈敏度優勢明顯，受基質干擾更小。采用優化后的GC-PCI-MS/MS方法，在空白面包樣品添加質量濃度為2、10、50 μg/kg的范圍內，氨基甲酸乙酯的回收率為89.3%～95.6%，日內RSD為1.3%～4.6%，日間RSD為4.5%～9.9%，檢出限為0.12 μg/kg，比一般選擇EI源的檢測方法檢出限(1.0 μg/kg)低5倍以上，因此優化后的方法選擇性強、靈敏度高、檢出限低、準確度好，適用于面包中氨基甲酸乙酯痕量分析。