紅腐乳發酵過程中菌群結構與風味相關性研究進展

張雅婷，孫娜，于寒松，朱先明，朱世杰，任大勇*

1(吉林農業大學 食品科學與工程學院，吉林 長春，130118) 2(長春市朱老六食品股份有限公司，吉林 長春，130500)

腐乳(sufu)又名豆腐乳、霉豆腐等，是一種利用微生物法改變植物蛋白風味的傳統大豆發酵制品[1],至今已有一千多年歷史。20 世紀50 年代前，釀造腐乳主要利用野生微生物培養毛坯；60 年代，應用純毛霉菌種進行發酵培養；70 年代，應用曲類(紅曲霉、米曲霉)參與后期發酵，稱“曲系應用發酵期”[2]；80年代，食用菌類(蘑菇、平菇、猴頭菇等)、花莖類(玫瑰花、桂花、生姜、人參)、曲類(豆曲、米曲、醬曲)、禽畜類(雞、火腿、水產類蝦子、蝦仁等)應用于后期發酵,形成了各具特色的風味腐乳；90年代,開始發展多菌種(毛霉、根霉、曲霉、酵母、小球菌等)及復合酶制劑釀造腐乳,進入了“生物技術應用期”，為腐乳發酵技術的研究與發展奠定了理論基礎。

由于后期發酵過程中灌制的湯料不同，形成了各具特色的風味腐乳，根據腐乳的風味可分為紅腐乳、白腐乳、青腐乳等。其中紅腐乳就是在湯料中加入了紅曲、面曲等,使紅腐乳呈現出鮮明的紅色。在紅腐乳發酵前期，主要是毛霉等微生物的生長發育期，豆腐坯周圍布滿菌絲，同時分泌各種酶，使豆腐中少量淀粉糖化和蛋白質逐步降解；發酵后期，毛霉、根霉與其他微生物共同發酵，經過復雜的生物化學變化，將蛋白質分解為胨、多肽和氨基酸等物質，同時生成一些有機酸、醇類和酯類等，賦予紅腐乳特有的風味[3-4]。近幾年，隨著測序技術和組學理論的快速發展，對紅腐乳發酵過程中微生物菌落結構的變化規律與產品風味之間的相關性有了更深入的了解，使得通過微生物調控技術來改善發酵工藝、提高產品風味穩定性成為可能。本文就紅腐乳發酵過程中微生物對風味影響進行了綜述。

1 腐乳中的微生物組成

由于地域和民族習俗不同，導致我國不同地區的腐乳使用的發酵菌種也有所不同。目前國內應用于腐乳生產的菌種大多為絲狀真菌(毛霉、根霉)和酵母菌，也有少數腐乳使用細菌發酵[5]，如黑龍江克東腐乳使用藤黃小球菌作發酵劑。由于傳統腐乳發酵是在開放式條件下進行的，除主要生產菌種外，還有其他微生物參與發酵[6-8](見表1)，因此造就了腐乳中微生物群落的復雜性和多樣性。目前并不清楚這些微生物在腐乳發酵過程中所起到的具體作用，但有研究表明，這些復雜的微生物群落對腐乳風味的形成起著十分重要的作用。

1.1 腐乳中的微生物組成

1.1.1 毛霉

毛霉是腐乳生產過程中的常用菌種，用于腐乳生產的毛霉主要有五通橋毛霉、腐乳毛霉、總狀毛霉、雅致放射毛霉、高大毛霉等。毛霉在腐乳生產過程中能釋放豐富的蛋白水解酶及其他有益酶系[9]，在α-淀粉酶的作用下將豆腐中少量淀粉轉化成糖；所含蛋白酶、肽酶可分解原料中的蛋白質，從而生成胨、多肽和氨基酸，是一種賦予腐乳營養和風味的重要途徑[10-11]。此外，毛霉可在腐乳坯表層均勻覆蓋 0.1～0.2 cm的嫩滑皮膜，賦予產品良好的外形及獨特的柔糯、細膩、潤滑的質地，提高了產品的感官品質。

1.1.2 根霉

用于腐乳生產的根霉主要有米根霉、華根霉、無根根霉等。根霉與毛霉同屬毛霉科，親緣很近，形態相似，分泌酶系類似。因此，這2種微生物在腐乳中的作用相似。不同的是，相比于毛霉適宜生長溫度偏低、受季節性限制等特點，現用的一些根霉呈現耐高溫的特性，在37 ℃環境下生長良好[12]。

1.1.3 酵母

酵母菌由于細胞內部含有豐富的酶系、蛋白質和維生素，被用作提高腐乳風味、縮短腐乳發酵周期的菌種。傳統發酵需4～6 個月，添加酵母菌后，生產周期縮短為60 d[13]。此外，也可添加酵母發酵產物來改善腐乳的風味，如曾衛國等[14-15]在腐乳發酵中添加酵母抽提物，有效的提高了產品中的呈鮮味物質次黃嘌呤核苷酸(IMP)和鳥嘌呤核苷酸(GMP)。

1.1.4 細菌

細菌型腐乳生產用菌大多為藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌和乳酸菌等。細菌在腐乳發酵過程中的作用與霉菌相似，利用細菌生長繁殖過程中分泌的酶使蛋白質分解，淀粉糖化。不同的是細菌發酵沒有菌絲，不能在腐乳坯體表面形成堅韌細膩的菌膜，因此產品外形較差，成為制約開發細菌型腐乳的重要限制條件。但細菌的發酵能力強，分泌的蛋白酶等酶活力較高且積累量大，氨基酸生成率較高，最終賦予腐乳鮮美醇厚、后味綿長的風味[16]。

1.2 腐乳不同發酵階段的微生物變化

腐乳發酵期間，前發酵中，白坯、晾曬期和腌坯期的微生物變化較大，其中菌落總數、芽孢桿菌數、乳酸菌數以及真菌數(毛霉，根霉等)都隨著發酵時間呈上升趨勢，分別達到5.10、5.01、4.94、4.54 lg CFU/g，在晾曬期，菌落總數、芽孢桿菌數和毛霉、酵母達到頂峰，分別為9.11、8.87、7.77 lg CFU/g，而乳酸菌數在腌坯期達到最大值8.28 lg CFU/g，之后由于食鹽鹽漬微生物數量明顯下降，表明食鹽對真菌及一些其他微生物有較強的抑制作用；當加入湯料進行后發酵時，細菌總數在早熟期(5～10 d)逐漸降低至約5.7 lg CFU/g，并在成熟10 d后穩定且稍微升高，蠟狀芽孢桿菌保持在3 lg CFU/g以下，乳酸菌數逐漸降低至<2 lg CFU/g，在成熟20和30 d后，腸桿菌科和真菌降低至不可檢測的水平[5,17]。

2 腐乳中的風味成分

風味是區別腐乳的一種重要感官特征，其研究對穩定產品質量和提高產品品質具有重要意義。盧靖等[18]利用固相微萃取法結合氣相色譜-質譜法分析了腐乳發酵過程中的揮發性風味成分，結果顯示腐乳中主要風味物質是酯類、酸類、醛類、酮類、醇類以及烴類；也有學者對不同品牌的腐乳風味成分進行了分析，結果均顯示酯類、醇類、酮類、醛類和 烴類是腐乳生產過程中主要的風味物質[19-21]。這些風味物質在腐乳發酵時期起到至關重要的作用，本文對不同品牌和不同品種的紅腐乳風味成分進行了總結，如表2所示。

注：“+”檢出；“-”未檢出。

2.1 腐乳不同發酵階段的風味變化

2.1.1 酯類

酯類是通過有機酸和醇類酯化反應生成的，被公認為腐乳中最重要的風味成分，占揮發性物質種類總數的34%。白坯中檢測出6種酯類物質，含量較低；經毛霉發酵形成毛坯后，增加到22 種，相對含量也隨之升高；腌坯過程由于輔料加入，烴類、醛類等物質含量升高，酯類物質含量明顯降低；后發酵階段，坯體中蛋白質等大分子物質降解以及生成的產物與輔料中的化學物質的協同作用使酯類物質不斷豐富，主要有乙酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、戊酸乙酯等，為腐乳提供了果香味和奶油香味等風味[22-23]。

2.1.2 醇類

醇的種類和含量與外界添加有關，在腌制時常常添加乙醇來增加其種類和含量。紅腐乳發酵過程中鑒定出12 種醇類物質(乙醇、戊醇、己醇和苯乙醇等)：白坯中僅有3種；毛坯和腌坯中由于真菌和細菌的代謝，醇類增多；后發酵醇類含量開始降低，因為其發生酯化反應或氧化反應生成酯類物質，賦予腐乳酒香味、玫瑰香味以及香草味等風味[24]。

2.1.3 醛類

醛類是通過氨基酸的Strecker降解以及酯類物質過氧化和降解2條途徑產生的。腐乳中鑒定出的醛類主要有正己醛、苯乙醛、壬醛、反式-2-壬烯醛等。發酵前期白坯中醛類物質風味含量為69.55%，中期經毛霉菌株發酵后相對含量迅速降低至7.92%，后期發酵階段則呈現不斷增長的趨勢，后期發酵36 d相對含量增長至16.7%。其中，正己醛含量高達51.45%；隨著腌制與后發酵的進行，其含量先降低后升高，這可能與輔料的加入以及不飽和脂肪酸的氧化有關，賦予腐乳甜味、水果味、堅果味以及焦糖味等風味[25]。

2.1.4 酮類

酮類化合物是脂肪和氨基酸在毛霉分泌的酶系的降解作用或者是美拉德反應作用下產生的。腐乳發酵過程中酮類物質含量相對較低，主要有2-庚酮、甲基庚烯酮、2-壬酮、1-辛烯-3-酮等，賦予腐乳香辣味、桂皮味、花香味、草本味及水果味等[26-27]。

2.1.5 烴類

腐乳中烴類物質主要有烯烴和烷烴兩大類，其中烷烴含量較低，貢獻較小；烯烴類物質從白坯到毛坯，含量由6.52%降到3.2%，隨著發酵時間的延長，其含量降至1.04%，可能是由于其化學性質不穩定易氧化造成的。其中蒎烯的松節油氣味、異松油烯的松木樹脂氣味等，均對腐乳的風味有一定的貢獻[28-29]。

2.2 不同品牌腐乳中的風味成分

地區的差異性導致環境中微生物的不同，產生不同的代謝產物導致風味物質各不相同。閆平平等[30]研究了鼎豐、王致和腐乳的風味成分差異性，其中王致和腐乳檢出醛類11 種、酮類4 種、酯類24 種、醇類7 種、呋喃類1 種、吡嗪類2 種、其他類5 種；鼎豐腐乳中檢出醛類15 種、酮類4 種、酯類27 種、醇類6 種、呋喃類1 種、其他類3 種。劉娜等[25]在測定紅腐乳中揮發性風味物質中得出，咸亨腐乳中醇類4種、酯類13種、萜烯類5種、雜環類1種、醛類5種、烯烴類1種、酚類1種、烴類2種、酮類1種；老才臣腐乳中醇類6種、萜烯類18種、酯類11種、雜環類2種、酚類1種、醛類6種、酮類3種、烯烴類1種；王致和腐乳中醇類4 種、酯類14 種、萜烯類10 種、雜環類2 種、醛類5 種、酮類3 種、烯烴類 3種、酚類1 種、烴類1 種。圖1比較了王致和、鼎豐、老才臣、咸亨4種腐乳風味，可以看出酯類、酮類、醛類、醇類為共有風味物質。

圖2顯示，共鑒定出63 種風味物質，其中酯類27 種(共有風味6 種：乙酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、丙酸乙酯、十六酸乙酯)、醇類9 種(共有2 種：1-辛烯-3-醇、苯乙醇)、醛類11 種(共有2 種：苯甲醛、3-甲基丁醛)、酮類6 種(共有1 種：2-庚酮)、雜環化合物2 種(共有1 種：2-戊基呋喃)、烴類8 種、酚類2 種，王致和腐乳中醇類含量達57.01%，高于其他3種腐乳含量，酒香最為明顯；老才臣和咸亨腐乳中的風味物質(酯、醛、酮、酸等)含量相似，其中老才臣腐乳中萜烯物質含量(茴香腦)遠高于其余3種腐乳含量，說明老才臣生產中使用辛香料用量要大于其余腐乳中的辛香料用量；另外咸亨腐乳酯類物質含量高于其余3種腐乳含量，甜香濃厚，這些區別使得4種腐乳香氣各有不同。

3 菌群結構與風味物質的關系

腐乳發酵過程中，微生物通過合成代謝產生風味物質及其前體物質，并產生相關的酶將原料中的大分子物質轉化為小分子風味物質。腐乳發酵過程中霉菌大量繁殖，酶系分泌活躍，能分泌各種酶系(蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、脂肪酶、肽酶等)，蛋白酶和肽酶使大豆蛋白水解成短肽和游離氨基酸,游離氨基酸在腐乳風味中有巨大的貢獻[7,31-32]，前發酵中白坯到毛坯階段，谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸以及賴氨酸含量增長迅速，其中苯丙氨酸和亮氨酸代謝形成2-苯乙醇和3-甲基丁醇。脂肪酶可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉酯化及酯類的逆向合成反應,在腐乳前發酵階段，脂肪酶降解豆腐坯中粗脂肪的能力加快，在腌坯階段由于輔料的添加使酶活力下降，游離脂肪酸生成速度隨之下降，在后發酵期由于酶活力的回升和后酵時間延長，游離脂肪酸總量逐步增加，醇類(乙醇、2-苯乙醇和3-甲基丁醇)的添加與脂肪酸(亞油酸、棕櫚酸、油酸)通過酯化反應形成相應的酯類(己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯和癸酸乙酯等)，同時酸類物質也出現明顯的增加[17,33-37]。

腐乳在前發酵階段葡萄球菌屬、未分類細菌和未分類的明串珠菌屬占優勢，隨著發酵的進行，芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬、鏈球菌屬占主導地位。其中乳桿菌屬、假單胞菌屬都與脂肪酸類、酯類物質具有很強的相關性，因為這些菌在代謝過程中產生乙酸、丙酸、乳酸等，而這些酸又是長鏈脂肪酸和酯的合成前體物質，乳桿菌屬在發酵過程中分解糖的能力較強，它消耗葡萄糖和果糖產生有機酸，其與乳酸呈正相關，同時乳桿菌屬生長使環境偏酸，從而能夠抑制腐敗性菌的生長，在發酵過程中具有一定的防腐作用；乳桿菌和酵母菌協同代謝出可發酵糖，產生乙醇、乳酸、乙酸等產物并結合成乳酸乙酯和乙酸乙酯等呈香物質；部分乳桿菌屬和明串珠菌屬發酵后能轉化糖生成雙乙酰、乙酰甲基原醇和3-羥基丁酮等芳香成分；此外，有的乳酸菌可將蛋白質分解成肽和氨基酸，賦予食品獨特的風味；假單孢菌屬能分解蛋白和脂肪，產生一些風味前體物質，它屬于嚴格的好氧菌，隨著發酵的進行含氧量降低以及酸度增加，其豐度逐漸降低。芽孢桿菌屬也與酯類物質有較強的相關性，芽孢桿菌屬在發酵過程中豐度不斷降低，因為芽孢桿菌多為好氧菌，在發酵前期氧氣量充足的情況下能夠很好生長，隨著發酵進行，含氧量降低逐漸抑制了芽孢桿菌的生長，豐度逐漸下降，而且發酵后期酒精度升高也會抑制芽孢桿菌的生長，芽孢桿菌屬在腐乳后發酵階段產生醇類、酯類等風味物質也是腐乳重要的組成風味；四聯球菌與胍基乙酸鹽，苯丙氨酸，色度和pH顯著相關；假單胞菌與2種碳水化合物(葡萄糖和阿拉伯糖)和8種含氮化合物(谷氨酸，丙氨酸，高絲氨酸，胍基乙酸，天冬氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸和焦谷氨酸)以及pH顯著相關；鏈球菌與6種碳水化合物(甘油，阿拉伯糖，乙酸，核糖，果糖和乳酸)和8種含氮化合物(谷氨酸，丙氨酸，纈氨酸，蘇氨酸，胍基乙酸，天冬氨酸，甘氨酸和苯丙氨酸)以及色度和pH顯著相關[16,38-40]；圖3清楚的表明腐乳發酵過程中風味物質的變化主要與細菌和霉菌有較強的相關性，同時腐乳菌群結構也是影響風味物質變化的本質原因。

4 展望

當前對不同地區、不同品牌腐乳中的菌群結構與風味物質間關系的研究已經成為熱點，但仍有諸多問題亟待回答，如腐乳體系中獨特的菌群結構是如何形成的，又是如何影響產品風味的？有哪些微生物起到了關鍵的成味作用？不同微生物間的互作機制是什么？腐乳基質條件下核心微生物的代謝途徑是否有別于其他環境？對于這些問題的探索將有助于開發優良發酵劑，實現定向利用微生物調控技術提高產品品質和穩定性，從而為開發傳統腐乳產品工業化生產新技術奠定基礎。