中國固態(tài)發(fā)酵白酒中功能細菌研究進展

郭學武，范恩帝，馬冰濤，李澤霞，張煜行，張志民，陳葉福，肖冬光*

1(河北衡水老白干釀酒(集團)有限公司，河北 衡水,053000) 2(工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學 生物工程學院，天津,300457) 3(中國輕工業(yè)濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵重點實驗室，四川 宜賓，644007)

白酒是中華民族的瑰寶，也是中華民族文化重要的載體，凝聚著我國古代勞動人民的智慧，至今已經(jīng)有幾千年的歷史。與世界其他國家的蒸餾酒相比，中國白酒獨具風格，具有豐富的不可比擬的風味，一是由于它的獨特工藝，二是由于豐富的微生物參與了白酒發(fā)酵[1]。

白酒屬于發(fā)酵食品，發(fā)酵離不開微生物的作用。細菌、霉菌和酵母是白酒釀造3大類微生物，在白酒生產(chǎn)中起著至關(guān)重要的作用。細菌是一類重要的白酒釀造微生物，目前白酒中報道的主要功能細菌及其主要代謝產(chǎn)物見圖1和表1。白酒功能細菌主要分布于酒曲、酒醅和窖泥，且以酒曲中最為豐富。白酒酒醅與窖泥中的細菌微生物種類及數(shù)量雖不及酒曲，但也含有較為豐富的細菌微生物，酒醅中的細菌源自于酒曲、窖泥和生產(chǎn)環(huán)境，窖泥中的細菌一方面來自于酒曲與酒醅，另一方面則是來自于制作窖泥的土壤，它們對窖泥香氣、白酒質(zhì)量、白酒產(chǎn)率等均有影響[2]。因此深入研究白酒中的細菌微生物具有重要的意義，不僅可以闡明細菌在白酒生產(chǎn)各個環(huán)節(jié)中的作用，詮釋白酒中細菌來源的微量成分，也可以進一步通過控制細菌微生物，科學地管理白酒生產(chǎn)，進而提升白酒品質(zhì)。

白酒的釀造方式是多微共酵，因此科學認識各種微生物在白酒中的作用，對于闡明白酒中復雜物質(zhì)的來源，科學提高白酒品質(zhì)與內(nèi)涵，提升白酒安全性有著非常重要的意義。細菌是白酒發(fā)酵中一類關(guān)鍵的、有著重要功能的微生物。鑒于近年來微生物技術(shù)的發(fā)展，白酒細菌微生物的研究也越來越深入，對各種細菌在白酒中的作用也得到了進一步的認識，本文綜述了近年來白酒功能細菌的研究進展，介紹了釀酒各個環(huán)節(jié)中主要功能細菌及其在白酒中的作用，旨在為白酒功能細菌的研究提供參考。

1 酒曲中功能細菌的研究

1.1 大曲中的細菌

大曲是以小麥、大麥和高粱等為原料經(jīng)粉碎制塊和自然接種而制成，大曲在白酒中應(yīng)用廣泛，濃香型、清香型、醬香型和兼香型白酒等均以大曲作為酒曲，在白酒生產(chǎn)中主要作為糖化劑和發(fā)酵劑，根據(jù)生產(chǎn)溫度不同可分為高溫大曲、中溫大曲和低溫大曲，且每種大曲的微生物群落差別巨大。大曲作為白酒發(fā)酵生產(chǎn)的動力，主要是由于大曲中豐富的微生物群落，而這其中更是少不了細菌的參與(主要細菌種類見表1)，并且大曲中的細菌微生物十分豐富，大曲中的主要細菌微生物為放線菌(53.85%)和成團泛菌(Pantoeaagglomerans，19.23%)，除此之外還包括芽孢桿菌、醋酸桿菌、乳酸菌等[3]。

醬香型白酒大曲是典型的高溫大曲，濃香型白酒大曲是典型的中溫大曲，清香型白酒大曲是典型的低溫大曲，國內(nèi)對于3類白酒大曲中的細菌多樣性研究較多，如WANG等[4]研究發(fā)現(xiàn)茅臺大曲中細菌微生物主要是由芽孢桿菌、乳酸桿菌和梭菌等組成，其中芽孢桿菌最為豐富；WANG等[5]從3種醬香型白酒大曲中共檢測出35種細菌，這些菌分別屬于放線菌、孢子菌和鏈霉菌等科；FAN等[6]經(jīng)研究指出瀘型白酒大曲原核微生物主要包括乳桿菌屬、巴氏桿菌屬、芽孢桿菌屬和雙歧桿菌屬等；ZOU等[7]研究發(fā)現(xiàn)濃香型白酒大曲中的細菌主要包括芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬和葡萄糖球菌屬等；ZHENG等[8]利用變性梯度凝膠電泳技術(shù)(polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)從汾酒大曲中分離鑒定出109株細菌，包括法國乳桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌和大型芽孢桿菌等；ZHANG等[9]通過對汾酒3種大曲的磷脂肪酸譜進行研究，發(fā)現(xiàn)清茬曲和后火曲中細菌所占比例均高于紅心曲，并推測是由于紅心曲中存在紅曲霉導致，同時也發(fā)現(xiàn)了白酒酸度、出酒率等與細菌有關(guān)。除各個白酒香型工藝不同導致大曲細菌微生物種類有差異外，大曲的生產(chǎn)地點對于細菌微生物種類也有一些影響，如南方大曲中存在沒食子酸葡萄球菌和腐生葡萄球菌，而北方大曲則沒有[10]。

白酒大曲中的細菌對于白酒質(zhì)量提高有著關(guān)鍵作用，它們具有以下功能，一是參與白酒生產(chǎn)主要代謝途徑，如LUO等[11]從瀘型大曲中分離出1株嗜熱葡萄球菌，具有產(chǎn)酯化酶功能；地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)等可以產(chǎn)生α-淀粉酶、糖化酶脂肪酶和蛋白酶[12]；枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等可以產(chǎn)生正戊醇、異丁醇、2,3-丁二醇等[13]；融合魏氏菌、枯草芽孢桿菌等可以合成乳酸、乙酸、丙酸等[13]。二是豐富白酒有益成分，如地衣芽孢桿菌功能大曲用于生產(chǎn)白酒，可以顯著提高吡嗪、萜烯等的含量，還可以產(chǎn)生地衣素[14]；從高溫大曲中分離得到的枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生乙偶姻、四甲基吡嗪等[15]。三是改善白酒風味，如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和短小芽孢桿菌等可以抑制鏈霉菌生長，進而減少土臭素以控制白酒的土臭味[16]；地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的地衣素可以增強酯類等物質(zhì)的揮發(fā)性，并且能顯著降低苯酚和苯乙醇等異嗅物質(zhì)的揮發(fā)性，同時還能產(chǎn)生吡嗪、愈創(chuàng)木酚等呈香物質(zhì)[14]；醋桿菌和氧化葡萄桿菌等醋酸菌可以提高白酒酸酯產(chǎn)量；鏈霉菌屬的放線菌具有產(chǎn)生酸、酯、醛等物質(zhì)的能力[17]；融合魏氏菌等乳酸菌不僅可以合成乳酸、乙酸等，還能促進乳酸乙酯的生成。

1.2 小曲中的細菌

小曲常見于南方，主要生產(chǎn)原料為米粉和米糠等，種類較多，可根據(jù)有無中草藥、原料、形狀和用途等進行分類，各地對于小曲也有不同的稱呼，如白曲、米曲、酒餅、觀音曲等。小曲雖然只是人為接種了霉菌和酵母菌，但小曲白酒常在開放式環(huán)境下生產(chǎn)，所以小曲中的細菌微生物也比較豐富(主要細菌種類見表1)，包括乳桿菌屬、沙雷氏菌屬和黃單胞菌屬等，其中優(yōu)勢細菌為乳酸菌(50%)[3]。

國內(nèi)對于小曲中細菌群落有較多研究，WU等[18]利用高通量測序技術(shù)在3個地區(qū)的小曲中共檢測到17種細菌，并發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)小曲的優(yōu)勢微生物和細菌種類均有所不同；王海燕等[19]利用PCR-DGGE技術(shù)研究湖北清香型小曲微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)小曲優(yōu)勢細菌為西貝利亞魏氏菌(Weissellacibaria)、梭菌、假單胞菌(Pseudomonas)等；WANG等[20]發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)小曲(酒餅、餅丸)與機制散曲細菌多樣性相似但高于機制散曲，傳統(tǒng)小曲優(yōu)勢菌為乳酸桿菌屬、片球菌屬、魏氏菌屬和醋酸桿菌屬等，機制散曲以乳酸桿菌屬、片球菌屬、不動桿菌屬和芽孢桿菌屬等為主，同時也指出由于散曲生產(chǎn)機器不完善，散曲中存在克雷伯氏菌和腸桿菌等病原菌；馮春等[21]對湖南和湖北多個酒廠小曲中的細菌進行分析鑒定，每克小曲細菌數(shù)量達到108個，其中以葡萄球菌屬、微球菌屬、酒明串珠菌屬等為主要細菌。

小曲中含有大量的功能細菌，主要具有以下功能。一是參與白酒生產(chǎn)主要代謝途徑，如枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生α-淀粉酶、糖化酶脂肪酶等參與白酒發(fā)酵[12]；嗜熱葡萄球菌可以產(chǎn)生酯化酶促進白酒酯類物質(zhì)的合成[11]；部分乳酸菌可以參與白酒中乙醇等主要物質(zhì)的合成。二是抑制雜菌，如乳酸菌及其產(chǎn)物可以抑制有害菌；蠟樣芽孢桿菌可以產(chǎn)生抑菌素防止阻尼病[22]；路氏腸桿菌(Enterobacterludwigii)對白色念球菌等多種病原菌均具有抑制作用[23]；枯草芽孢桿菌可產(chǎn)生20多種抗生素，能抑制多種有害微生物[24]。三是增加白酒風味，如小曲的優(yōu)勢細菌-乳酸菌可以產(chǎn)生乳酸，進而促進呈香物質(zhì)乳酸乙酯的生成，枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生甲酯類物質(zhì)，蠟樣芽孢桿菌經(jīng)自身代謝活動可以產(chǎn)生己酸乙酯[13]。

1.3 麩曲中的細菌

麩曲一般是以麩皮為原料接種純種霉菌(曲霉、根霉等)制成的，具有生產(chǎn)周期短、出酒率高等特點，在白酒生產(chǎn)中主要起糖化作用，一般需要與酵母一起使用。麩曲生產(chǎn)過程中只是人為接種了霉菌，所以麩曲中細菌數(shù)量和種類相對較少(主要細菌種類見表1)，它們主要來自于白酒生產(chǎn)環(huán)境中，GOU等[3]在麩曲中發(fā)現(xiàn)的細菌包括枯草芽孢桿菌(3.33%)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus，3.33%)、蠟樣芽孢桿菌(16.67%)、貝氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii，23.33%)和屎腸球菌(Enterococcusfaecium，46.67%)。

麩曲中雖然細菌數(shù)量不多，但是也存在一些功能細菌，具有以下功能：一是參與白酒生產(chǎn)主要代謝途徑，如貝氏梭菌可以參與丁醇的合成[23]；蠟樣芽孢桿菌可以產(chǎn)生己酸乙酯等呈香物質(zhì)[25]；枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生α-淀粉酶、糖化酶脂肪酶等參與白酒發(fā)酵，還能夠產(chǎn)生琥珀酸，從而降低乳酸等功能[12,26]。二是抑制有害菌，如屎腸球菌作為一種人體益生菌，可以抑制大腸桿菌、沙門氏菌等腸道病原菌，也可以用于治療腹瀉，改善腸道健康等；戊糖片球菌可以產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)細菌素，可以有效抑制李斯特菌等有害微生物。

白酒麩曲均為人工接種，傳統(tǒng)麩曲僅接種純種霉菌，導致其中的細菌種類較少，但是由于麩曲具有生產(chǎn)周期短、出酒率高等優(yōu)點，所以細菌麩曲已經(jīng)被研究用于生產(chǎn)多種香型白酒，如謝國排等[27]在麩曲中添加耐高溫且具有產(chǎn)蛋白酶能力的地衣芽孢桿菌，最終提高了芝麻香等香型白酒的出酒率與質(zhì)量；趙德義等[28]將添加了嗜熱芽孢桿菌的麩曲用于生產(chǎn)芝麻香型白酒，成品白酒優(yōu)級品率提高了23%；趙希玉等[29]從茅臺大曲中從篩選出6株具有產(chǎn)醬香功能的嗜熱芽孢桿菌制作麩曲，再混合河內(nèi)白曲、生香酵母曲，用于生產(chǎn)醬香型白酒，成品白酒風格獨特且兼有醬香型白酒特點。

2 酒醅中功能細菌的研究

酒醅是由蒸煮的糧谷原料(高粱、小麥、糯米等)與酒曲2部分混勻組成，酒醅在酒窖中經(jīng)過酒曲微生物的發(fā)酵作用，再通過蒸餾即可生產(chǎn)白酒，在濃香型白酒生產(chǎn)過程中酒醅又直接與窖泥和空氣接觸，窖泥和空氣中的微生物可以直接遷移到酒醅中，故而酒醅中的微生物會與酒曲、窖泥和空氣中的微生物有所關(guān)聯(lián)，并且上層酒醅微生物數(shù)量更加豐富，說明酒醅微生物多數(shù)可能為好氧菌或是兼性厭氧菌。

與酒曲和窖泥相比，國內(nèi)對于白酒酒醅中的細菌微生物的相關(guān)研究較少，但是酒醅中的細菌直接參與白酒生產(chǎn)，并且其代謝物會對白酒風味有好有壞的影響，所以研究酒醅中的細菌對保證白酒質(zhì)量會起到巨大的作用。每種香型白酒由于生產(chǎn)環(huán)境和工藝的不同，導致細菌種類和豐富度有所不同，各香型白酒酒醅細菌及其研究現(xiàn)狀見表2。

白酒酒醅發(fā)酵結(jié)果的好壞很大程度上決定了白酒質(zhì)量，而對酒醅發(fā)酵影響最大的就是其中的微生物，細菌自然被包括在這些微生物中，在各個香型白酒酒醅中均有發(fā)現(xiàn)細菌(主要細菌種類見表1)，這些酒醅細菌在白酒生產(chǎn)中起著關(guān)鍵作用，一是參與白酒生產(chǎn)主要代謝途徑，如瀘型白酒酒醅中存在較大比例的梭菌(最高可達6.67%)，梭菌可參與氨糖、果糖等的代謝[37]；產(chǎn)色高溫單胞菌(Thermomonosporachromogena)具有降解淀粉、纖維素和蛋白質(zhì)的能力；枯草芽孢桿菌具有產(chǎn)纖維素酶的能力[38]；解淀粉芽孢桿菌可產(chǎn)生氨基甲酸乙酯水解酶用于降解致癌物質(zhì)—氨基甲酸乙酯。二是增加白酒風味，如酒醅梭菌可以合成丙酸、丁酸和丁酸乙酯，賦予白酒菠蘿香氣[37,39]；乳酸菌可以促進乳酸乙酯的產(chǎn)生；地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的地衣素可以降低異嗅物質(zhì)的揮發(fā)性，改善白酒風味[14]；枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生吡嗪類物質(zhì)，賦予白酒烘烤香氣[40]。三是豐富白酒活性成分，如乳酸菌可以產(chǎn)生一種中性黏稠的胞外多糖[41]；枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌可以產(chǎn)生四甲基吡嗪、萜烯和地衣素等，同時枯草芽孢桿菌也能合成抗氧化活性肽[14,40]。

3 窖泥中功能細菌的研究

窖池是生產(chǎn)濃香型白酒的必要設(shè)備之一，在白酒生產(chǎn)行業(yè)眾所周知的一句話是“千年老窖萬年糟，酒好全憑窖池老”，優(yōu)質(zhì)濃香型白酒更離不開老窖，這主要是由于窖池底部的窖泥富含微生物，窖泥中的微生物可遷移到酒醅并參與白酒發(fā)酵。窖池使用時間越長，窖泥中的微生物越多，并且老窖池中的窖泥比人為陳化窖池中的窖泥香氣強烈[42,43]。

窖泥微生物包括細菌和真菌(主要細菌種類見表1)，其中以革蘭氏陽性菌和厭氧菌為主[43]。國內(nèi)有許多研究者著力于分離篩選窖泥中的功能細菌和探究窖泥細菌群落，如CHAI等[44]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)瀘州老窖窖泥中的梭菌主要屬于尾狀梭菌科(32.0%，Clostridialesincertaesedis)、螺旋桿菌科(18.3%，Heliobacteriaceae)和梭菌科1(8.4%，Clostridiaceae1)，而氫孢菌屬(Hydrogenispora)、沉積桿菌屬(Sedimentibacter)和梭菌屬(Clostridium)是梭菌的主要屬，同時分離到19種具有產(chǎn)丁酸能力的梭菌，其中有10種是首次從窖泥中分離到；LIU等[45]從瀘型酒窖泥中分離到1株新型厭氧膨脹梭菌，可以葡萄糖等為原料發(fā)酵產(chǎn)生乙醇、乙酸和丁酸等；HU等[46]從瀘州老窖等濃香型白酒廠窖泥中分離到15株梭菌屬和8株芽孢桿菌屬，均具有產(chǎn)己酸等能力；ZHANG等[47]利用PCR-DGGE技術(shù)從瀘型白酒窖泥中鑒定了14個屬的細菌，包括梭菌屬、芽孢桿菌屬、乳酸菌屬、葡萄球菌屬等；ZOU等[7]研究指出窖泥中的細菌主要包括梭菌屬、乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、放線菌屬等，其中優(yōu)勢菌為梭菌屬，常見的包括膨脹梭菌、丁酸梭菌等。

窖泥細菌不僅種類豐富，在白酒生產(chǎn)中也起到關(guān)鍵作用。一是參與白酒生產(chǎn)主要代謝途徑，如蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌可以產(chǎn)生內(nèi)肽酶、氨肽酶、羧肽酶參與白酒生產(chǎn)；解淀粉芽孢桿菌能產(chǎn)生2種淀粉酶、糖化酶和脫支酶；吲哚梭菌(Clostridiumindolis)和產(chǎn)孢梭菌(Clostridiumsporogenes)等可以合成1-葵醇、正辛醇、十一烯醇和苯乙醇等醇類；膨脹梭菌能利用葡萄糖等底物產(chǎn)生乙醇[45]；梭菌和芽孢桿菌通過丁酸激酶途徑合成丁酸，同時梭菌也可以通過丁酰輔酶A:乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶途徑合成丁酸[44]。二是增加白酒風味，如克氏梭菌可以合成己酸、丁酸、辛酸及3者對應(yīng)的乙酯產(chǎn)物[46]；梭狀芽孢桿菌可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸、乙醇等物質(zhì)，而短鏈脂肪酸與乙醇反應(yīng)又可以進一步合成己酸乙酯、丁酸乙酯等呈香物質(zhì)，地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等可以產(chǎn)生乙偶姻和2,3-丁二酮等物質(zhì)，促進白酒香氣和甜味的產(chǎn)生[48]；甲烷菌(Methanobacteria)在合成甲烷的同時也會促進乙酸、己酸、己酸乙酯等的產(chǎn)生[49]；鏈霉菌屬為主的放線菌具有產(chǎn)生丁酸乙酯、己酸乙酯和丁烯酸甲酯等的能力[17]。

4 展望

白酒釀造微生物是近年來備受關(guān)注的研究領(lǐng)域，白酒釀造過程中的細菌及其功能是其中極為重要的研究內(nèi)容之一。白酒生產(chǎn)過程中，微生物是固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)白酒的基礎(chǔ)，在這其中細菌對白酒的貢獻尤為重要，酒曲、酒醅和窖泥中均有細菌存在，種類豐富且數(shù)量巨大。白酒功能細菌的研究涉及到多種細菌，它們在釀酒的各個環(huán)節(jié)通過自身或者其代謝產(chǎn)物影響白酒的品質(zhì)和風味。同時，功能細菌的代謝還會影響其他白酒微生物如酵母和霉菌的代謝。目前研究某種細菌功能主要是針對單一菌株，且許多細菌的代謝產(chǎn)物及其代謝途徑尚不清楚，而且還存在著很多較難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)微生物，加上白酒自然發(fā)酵條件，種類繁多的微生物之間還存在相互作用，致使判斷白酒中細菌的功能更加困難。由于整個白酒釀造體系涉及到多種細菌、酵母和霉菌的參與，同時細菌還與其他微生物之間相互作用，因此細菌對白酒的影響作用是錯綜復雜的。白酒釀造過程中的各微生物之間相互作用,共同構(gòu)成了一個復雜、精細、微妙的白酒釀造微生物代謝網(wǎng)絡(luò)。

因此,要闡明細菌在白酒生產(chǎn)中的作用與機理就需要著眼于一個新的角度即微生物的群體效應(yīng),在白酒釀造體系中，細菌、霉菌和酵母等微生物共同存在于一個發(fā)酵體系中，它們互相之間存在共處、互生、共生、拮抗、競爭等關(guān)系，而且這些微生物的代謝產(chǎn)物或中間產(chǎn)物也被互相利用。另一方面，白酒細菌的功能與機理研究也為其他研究者提供了新的啟示，比如中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中還有很多類似于白酒的發(fā)酵體系，如醋、醬油、豆瓣醬、辣椒醬等等，白酒功能細菌的研究也將為這些研究提供參考和借鑒。挑戰(zhàn)與機遇并存,白酒功能細菌的研究仍需要大量具有指導意義的研究工作，以更好闡釋白酒的內(nèi)涵與價值。