乳中miRNA穩定性與功能研究進展及其作為質量控制指標的分析

王一凡，劉永峰

(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安，710062)

乳品是人們日常生活中經常食用的食品，含有豐富的營養素。乳中的大量營養素包括蛋白質、乳糖、脂肪，微量營養素包括維生素和礦物質。乳中還含有促進人體健康的生物活性物質，如表皮生長因子、血管內皮生長因子、促紅細胞生成素、神經生長因子、生長調節因子、環磷酸腺苷和免疫相關因子如免疫細胞、細胞因子、趨化因子等[1-2]。母乳是新生兒的首要營養物質，其含有豐富且均衡的營養物質，與嬰兒的生長發育密切相關。母乳可以通過免疫細胞和免疫分子，例如免疫球蛋白直接抵御病原體[3-5]；許多與免疫相關的物質存在于母乳中，它們對嬰兒的影響已被廣泛認可[6-7]。除了這些免疫成分外，母乳還含有一些非特異性因子，如溶菌酶(通過破壞細菌細胞壁抑制許多細菌的生長)、乳鐵蛋白(母乳中的一種多功能蛋白質，它通過刺激細胞因子的產生來限制細菌的生長)和低聚糖(阻止微生物附著于嬰兒的黏膜，從而預防感染)，可以增強嬰兒的免疫功能[8]。

母乳及各種動物乳中還含有一些其他活性成分，可能對機體的健康有益，近期許多研究報道了母乳[9]、牛乳[10]、豬乳[11]和羊乳[12]中miRNA的表達，發現大量的乳中miRNA與免疫調節有關。ZHOU等[13]研究發現，超過60%的免疫相關前體miRNA(pre-miRNA)存在并富集于母乳中。通過對母乳源性miRNA的表達譜研究表明，這些miRNA可以促進嬰兒的免疫系統發育，并可能對兒童健康產生有益影響[14-15]。此外，牛乳miRNA可能在抗變態反應和自身免疫性疾病的發展中發揮重要作用[16-17]。本文對miRNA的合成和免疫功能以及miRNA在乳中分離提取和穩定性進行簡要概述，并分析了乳中miRNA作為潛在標記物用于檢測乳品質量，從而為乳中miRNA的研究提供新方向。

1 miRNA的合成及功能簡介

miRNA是真核生物中廣泛存在的一種長度大約為22 nt的非編碼RNA。miRNA通過調控基因表達進而調控細胞的分化、繁殖、死亡等生理過程[18-20]。miRNA失調在疾病發展中發揮著重要作用，如癌癥和糖尿病[21-23]。miRNA主要通過結合靶基因的3’非編碼區誘導目標靶mRNA降解或阻斷蛋白質翻譯，是細胞轉錄水平的一種重要調控手段。具體合成miRNA的過程為：第一步，miRNA對應基因通過RNA聚合酶Ⅱ轉錄出初級miRNA(pri-miRNA)，pri-miRNA通常包含幾百個堿基對；第二步，微加工復合體切割pri-miRNA，同時在Drosha酶和Pasha酶的作用下加工形成約70 nt的“頸環前體”，即pre-miRNA；第三步，在細胞核轉運蛋白Exportin5和Ran-GTP等作用下，細胞核中的pre-miRNA被轉運到細胞質中，它們在細胞質中經過Dicer酶的剪切和雙鏈RNA結合酶的作用進一步加工成約22 nt的miRNA雙鏈。解鏈后，成熟的miRNA與RNA的誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex,RISC)結合，然后與目標mRNA互補結合，發揮miRNA的生物學功能，另一條序列則會立即被降解[24]。雖然miRNA研究時間較短，但已成為基因表達調控的熱點領域。

2 乳中miRNA的分離提取與穩定性研究

在血漿[25]、血清[25]、唾液[26]、尿液[27]和牛乳[28]中都報道發現了miRNA。乳中miRNA鑒定是乳品研究中的新興領域，對于乳質量檢測和分析有著重要意義。目前一些研究集中在miRNA提供營養方面，miRNA參與很多生物過程，因此人們對miRNA作為牛乳生物活性成分的研究產生了興趣[29-32]。最近的研究發現包裹在外泌體和微泡中的miRNA可以作為細胞間信使，并在進入其他細胞時影響細胞進程[33-35]。

2.1 乳中miRNA的分離提取

miRNA可以從乳清(whey)、微泡(microvesicle)、外泌體(exosome)中分離提取出來，提取方法見表1。CHEN等[36]用有機法提取了初乳中miRNA；KOSAKA等[9]和IZUMI等[37]用離心柱法提取乳清中miRNA；SUN等[38]和HATA等[10]分別用超速離心法和有機法提取乳中微泡的miRNA；IZUMI等[39]使用有機法提取乳中外泌體的miRNA。HATA等[10]在牛初乳中提取的總RNA含量大約是成熟乳的1.7倍。

2.2 乳中miRNA的穩定性研究

由于體液中同時存在RNA和RNase，miRNA的穩定存在表明它們可以不被RNase消化[25]。將人工合成的RNA(包括miRNA和mRNA)加入牛乳中很快就會被降解，而牛乳本身的miRNA和mRNA卻可以在酸性條件及RNA酶處理后仍然保持穩定[36]。母乳中miRNA經RNase、反復凍融、低pH處理沒有發生明顯的變化，這表明miRNA可以抵抗嬰兒胃腸環境，進而被小腸吸收，最終影響嬰兒的免疫系統[9]。母乳中存在外泌體和微泡，它們可以將miR-NA包裹在其膜內從而不被降解[33,40]。外泌體和微泡具有磷脂雙分子層膜結構，通常由多種細胞分泌而來，其中包裹蛋白質、RNA、miRNA等多種物質，由于磷脂雙分子膜結構的存在從而保護miRNA不被降解。因此，由于miRNA特殊的穩定性保證其在母乳中順利通過嬰兒胃腸道被小腸吸收。外泌體對miRNA在腸內的轉移具有重要作用，可以防止細胞降解并促進內吞作用[41-42]。CHEN等[36]發現miRNA不僅存在于牛乳中，在液態乳制品、乳粉中也存在miRNA，說明這些miRNA穩定存在于牛乳及牛乳制品中。牛、羊乳被廣泛應用于乳品行業，而大多數的嬰兒乳粉以牛乳蛋白為基礎，有研究顯示，在商業巴氏殺菌乳制品中的miRNA可被成年人吸收[43]。此外，有研究表明牛乳外泌體包裹的miRNA可以進入結腸癌細胞[41]、腸細胞[41]、腎細胞[43]、巨噬細胞[44]、以及人外周血單核細胞[43]。

3 乳中miRNA的免疫功能研究

研究發現，miRNA在調控重要生物過程的基因表達中發揮作用，包括細胞增殖和分化、組織發育和免疫反應[5,9,29]。miRNA有助于調節免疫細胞的發育，調節先天免疫反應和獲得性免疫反應[5]。最近有研究表明，細胞外的miRNA通過包裹在外泌體或微泡中，穩定地存在于體液中，可能在免疫應答過程或在細胞間信息交流中扮演重要角色[9,27,45]。許多miRNA參與各種免疫相關的信號傳導網絡，miRNA可以調控免疫細胞的各個方面，如發育、增殖、成熟、存活、穩態、分化、轉移、細胞因子表達[45]。例如在T細胞中，miR-181a調節細胞敏感性和增殖；miR-155調節CD8+T細胞應答；miR-146a通過NF-kB信號激活T細胞受體。

在不同的泌乳階段，乳中miRNA表達量不同。與成熟乳相比，牛初乳中的miRNA具有更高的表達[36,38,44]。初乳的外泌體和微泡中所含免疫相關的miRNA含量高于成熟乳，并且這些miRNA可以進入受體細胞中影響基因表達；初乳中富含抗體、溶菌酶、白細胞、寡糖等成分都具有免疫功能[38]。可見，泌乳早期的乳中含有更高含量的miRNA，可以在提供免疫保護方面發揮作用。

3.1 母乳miRNA免疫功能

2010年KOSAKA等[9]首次發現母乳中含有miRNA，且哺乳期前6個月乳中與免疫相關的miRNA含量較高，隨后其含量隨著時間的推移而逐步下降。與其他體液相比，母乳中含有大量的總RNA，母乳中高含量miRNA已被認為與免疫相關[9,27,45]。免疫相關的miR-155、miR-181a、miR-181b、miR-17-92、miR-125b、miR-146b、miR-223 和let-7i，在母乳乳清中廣泛存在[9]；免疫相關的miR-148a-3p、miR-30b-5p、miR-182-5p、miR-200a-3p、miR-29a-3p、miR-141-3p、miR-146b-5p、let-7f-1-5p、let-7f-2-5p、let-7a-2-5p和let-7a-3-5p在母乳外泌體中廣泛存在[13]；miRNA不僅在母乳的乳清和外泌體中存在，也在母乳的脂質中廣泛存在，與免疫相關的miRNA有hsa-miR-148a、hsa-let-7a、hsa-miR-200c、hsa-miR-146b-5p、hsa-let-7f、hsa-miR-30d、hsa-let-7b和hsa-miR-21[46]。

3.2 牛乳miRNA免疫功能

牛乳一直以來都是人類廣泛食用的乳制品，也用于制造嬰兒配方乳粉。在牛乳中發現的miRNA其中大部分是與免疫相關的。IZUMI等[44]在牛乳清中發現與免疫相關的miRNA，包括miR-15b、miR-27b、miR-106b、miR-155、miR-223、miR-34a、miR-130a等。在牛乳微泡中發現與免疫相關的miRNA，包括miR-24、miR-30d、miR-93、miR-106a、miR-181a、miR-200a、miR-451、miR-223等[47-53]。

3.3 豬乳miRNA免疫功能

GU等[11]在豬乳外泌體中發現了12種豬特異的且含量豐富的miRNA，分別是miR-148a-3p、miR-182-5p、miR-200c-3p、miR-30d-5p、miR-574-3p、let-7a-1-5p、miR-30c-2-5p、miR-30c-1-5p、miR-191-5p、miR-375-3p、miR-27b-3p和miR-21-5p，這些miRNA被證明具有免疫功能。

4 乳中miRNA作為質量控制指標的分析

近年來，乳制品安全事件頻繁出現，許多不法商販通過向牛乳中摻水牟取不正當利益。由于向牛乳中加水會導致除水以外的各項指標降低，因此，為了提高各項檢測指標，不法商販在牛乳中添加水后又向其中加入各種添加劑，并通過反復勾兌來使牛乳達標。最常用的添加劑有以下幾種：蛋白(提高蛋白指數)、乳清粉(提高各項指數)、糊精、脂肪油(提高脂肪指數)、二合一(可提高相應各項指數，對蛋白指數最有效)[54]。其中，“二合一”的典型案例是三鹿乳粉事件中不法商販向牛乳中加水后又加入三聚氰胺。

現有的檢測牛乳質量的方法主要是檢測蛋白質、脂肪和碳水化合物等標志物。雖然這些標志物易于制定行業標準，但都容易被人為操縱，因而難以實現牛乳質量的檢測。最根本的牛乳質量檢測方法是應找到一種在牛乳中穩定存在，而稀釋后該成分會變化，但不受添加劑影響的物質。DNA分子以其高穩定性逐漸成為食品品種鑒定的目標分析物，基于DNA運用PCR技術檢測不同動物乳的摻假[55-56]。早在2014年，劉永峰等[57]建立了從牛乳中提取大片段DNA(>1000 bp)的方法，并在后續的研究中優化和擴展了DNA的提取方法[58-60]，基于這些方法提取乳粉中的DNA用于檢測乳粉摻假，通過PCR擴增，最低檢測到牛乳粉中摻假0.1%的羊乳粉[61]。DNA可以用于乳品質量安全研究，同樣作為核酸的RNA也有相應研究結果。張辰宇等[54]發現miRNA存在于原乳、商品液態乳制品及乳粉中，牛乳中的特異性miRNA圖譜不受任何添加劑的影響，并且與其他動物中miRNA圖譜不同。牛乳中特異性miRNA圖譜是一種用于檢測牛乳質量的完美標志物。因此，通過檢測這些miRNA中的任意一種或幾種就可以確定原乳的質量，從而杜絕不法分子向牛乳中摻入其他物質的可能。

CHEN等[36]研究表明，通過檢測乳制品中的蛋白質或氮含量，已經不能真實地反映乳品質，但通過檢測特定的miRNA含量能準確地反映乳品質，評估正常乳和摻假乳之間的miRNA水平，比檢測蛋白質或氮含量更可靠[36]。因此，評估正常牛乳和摻假牛乳的miRNA水平比其他標記物，如蛋白質、氮等，提供了更好的牛乳質量控制選擇。

張辰宇等[62]通過檢測乳制品中的miRNA進而鑒別乳制品，研究發現，若所測得的miRNA種類及含量與初乳樣品的miRNA表達譜相近或相同，則鑒定此樣品為初乳制品；若所測得的miRNA種類及其含量與成熟乳樣品的miRNA表達譜相近或相同，則鑒定為此樣品為成熟乳制品。因此，牛乳中所含miRNA可以作為潛在的牛乳質量標記物，將很有可能給整個乳制品行業，尤其是牛乳質量控制領域帶來一場革命。

5 展望

在相關科學研究中，應結合實際情況選擇最優的乳中miRNA提取方法。乳中外泌體和微泡中包裹miRNA在細胞中發揮重要作用，但具體機制還有待于深入探索。母乳中miRNA具有免疫功能，通過哺乳傳遞給嬰兒，現有的嬰幼兒配方乳粉中未考慮將miRNA作為營養素進行添加，期望通過未來對乳中miRNA的深入研究可以闡明各種miRNA對機體的作用機制，從而有利于研制出適用于不同嬰幼兒的含miRNA的配方乳粉或輔助食品。