納米磁珠-電化學適配體傳感技術檢測牛奶中氨芐青霉素

朱俊亞，李 芳,2,*，趙蘭馨，李席席，劉云宏,2

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.河南省食品原料工程技術研究中心，河南 洛陽 471023）

氨芐青霉素（ampicillin，AMP），又稱氨芐莫林，是一種β-內酰胺類抗生素，因其耐酸耐霉、殺菌活性強、毒性低及廣譜廉價等優點，廣泛應用于奶牛養殖產業中[1]。經常食用AMP殘留奶制品會增強機體耐藥性，造成肝腎功能損害，嚴重的還會影響機體耐藥基因的傳遞和患病醫學治療[2-3]。為保障人體健康，許多國家和地區都對AMP在牛奶中的最大殘留量進行了規定：歐盟標準為4 μg/kg（約1.0×10-8mol/L）[4]，美國標準為10 μg/kg（約2.5×10-8mol/L）[5]，我國農業部最新修訂頒布的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》標準為10 μg/kg（約2.5×10-8mol/L）。國內外對牛奶中AMP最大殘留量的強制規定推動了AMP檢測方法的發展與創新。目前，常用的AMP檢測方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、液相-質譜聯用法等[6]，這些方法存在過程繁瑣、儀器昂貴和操作復雜等缺點。近年來，免疫分析（immunoassay，IAs）法應用日趨廣泛，但由于AMP是小分子化合物，存在抗體質量不穩定、方法特異性差等問題，限制了IAs法的普及[7]。適配體克服了傳統抗體的缺點，具有篩選周期短、合成批次間差異小、親和性和特異性高等特點[8-9]，為小分子化合物檢測提供了一種可替代的識別元件。以適配體作為識別元件的傳感檢測技術開始嶄露頭角[10]。曾憲冬等[11]利用核酸適配體-金納米顆粒比色傳感技術實現了對赭曲霉毒素A的快速、高效檢測。Ma Qiang等[12]利用金納米顆粒和單鏈DNA構建比色適配體傳感器，實現了牛奶和雞蛋中妥布霉素的有效檢測。已報道的適配體傳感檢測技術多采用金納米顯色技術[13-15]、熒光光譜分析[16-18]，對于將納米磁磁與電化學技術相結合運用于食品中AMP檢測的報道甚少，仍有待深入研究。

本研究以AMP為研究對象，選擇納米磁磁為載體，將兩者共價偶聯。在AMP-適配體特異性結合基礎上，以偶聯的AMP為識別探針，與待測樣中的AMP共同競爭反應體系中的適配體和辣根過氧化物酶，并利用磁性玻碳電極將上述磁磁吸附于電極檢測表面直接進行電化學測定，構建可用于牛奶中AMP高效檢測的電化學適配體傳感檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羧基納米磁磁 英芮誠生化科技（上海）有限公司；AMP（≥98.89%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；AMP適配體（5’-biotin-GCG GGC GGT TGT ATA GCG G-3’）生工生物工程（上海）股份有限公司；鏈霉親和素修飾的辣根過氧化物酶（streptavidin-horseradish peroxidase，SA-HRP） 北京博奧森生物技術有限公司；其他試劑均為分析純。

實驗操作過程中所用溶液均為超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm）配制。

1.2 儀器與設備

TG16-WS型臺式高速離心機 湘儀離心機儀器有限公司；KQ2200型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；BE-1100型四維旋轉混合儀 海門市其林貝爾儀器有限公司；CHI620E型電化學工作站 上海辰華儀器有限公司；HRCLJ-02型磁性分離架 河南惠爾納米科技有限公司。

電化學檢測使用三電極體系：磁性玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為對電極，購自武漢高仕睿聯科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗原理

基于電化學適配體傳感器檢測牛奶中AMP的原理如圖1所示。采用碳二亞胺交聯法制備了修飾有AMP的磁磁（磁性識別探針），其可與適配體特異性結合構成磁性AMP-適配體復合物，由于所合成適配體的5’端修飾有生物素，因此當加入SA-HRP后，在鏈霉親和素-生物素作用下，又可將HRP偶聯到磁磁表面，隨后便可利用磁性玻碳電極，將上述磁磁（磁性信號探針）磁吸固定于電極的檢測表面[19]，在HQ、H2O2條件下進行電化學檢測。該檢測體系是以AMP-適配體競爭模式為基礎進行的，當檢測體系中存在游離的（待測）AMP時，會和磁磁表面修飾的AMP競爭與適配體結合的機會，形成較多的游離（待測）AMP-適配體復合物，導致磁性AMP-適配體復合物數量的減少，使得能夠結合到磁磁表面的HRP數量也隨之減少，故獲得較低的電化學檢測信號。相反，當檢測環境中不存在游離的（待測）AMP時，則不存在上述競爭過程，因而可獲得較高的電化學檢測信號。該適配體傳感器通過競爭前后顯著的電化學信號變化實現對牛奶中AMP的有效檢測。

圖1 適配體傳感器檢測AMP原理圖Fig. 1 Schematic illustration of the electrochemical aptasensor for the detection of ampicillin based on competitive format

1.3.2 適配體傳感器的構建

1.3.2.1 磁性AMP識別探針的制備

主要步驟參照文獻[20]，采用碳二亞胺交聯法制備磁性AMP識別探針。于1 mg羧基納米磁磁中加入1 mL 15 mmol/L 2-(N-嗎啉)乙磺酸（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MES）偶聯液洗滌2 次。加入100 μL 15 mmol/L MES偶聯液和100 μL EDC溶液重懸磁磁，室溫條件下于四維旋轉混合儀上避光活化。磁分離，用1 mL 15 mmol/L MES偶聯液洗滌2 次。加入500 μL AMP溶液，室溫條件下于四維旋轉混合儀上避光孵育。產物用PBST（0.01 mol/L PBS，0.05% Tween-20，pH 7.4）洗滌2 次，再加入1 mL PBS重懸，4 ℃貯存。

1.3.2.2 磁性AMP-適配體復合物的制備

磁分離去上清液，加入適量待測AMP和適配體溶液，混合均勻，室溫條件下于四維旋轉混合儀上避光孵育一段時間。產物用PBST洗滌3 次。

1.3.2.3 磁性信號探針的制備

方上述復合物中加入200 μL SA-HRP稀釋液（1∶1 000），室溫條件下于四維旋轉混合儀上避光孵育一段時間。產物用PBST洗滌3 次，再加入200 μL PBS重懸，4 ℃貯存備用。

1.3.2.4 適配體傳感器的組裝

利用磁性玻碳電極具有的磁性吸附作用，將上述磁磁（磁性AMP信號探針）磁吸固定于磁性工作電極檢測表面，用于后續電化學檢測。

1.3.3 工作電極的預處理

工作電極選擇磁性玻碳電極，依次用0.3、0.05 μm的拋光粉（Al2O3）打磨拋光至鏡面，隨后依次用超純水、體積分數50%的乙醇溶液、超純水超聲清洗。最后置于0.5 mol/L H2SO4溶液中用循環伏發法活化，直至得到穩定的循環伏發曲線為止，處理后的電極用氮氣吹干備用。

1.3.4 電化學檢測

適配體傳感器的電化學表征通過循環伏發法在含1 mmol/L K3[Fe(CN)6]和1 mmol/L K4[Fe(CN)6]的0.1 mol/L KCl溶液中測定。循環伏發法檢測參數如下：初始電位-0.1 V、終止電位0.6 V、掃描速率0.05 V/s、掃描圈數2、取樣間隔0.001 V、靜置時間2 s。

氧化電流通過線性掃描伏發法在含HQ、H2O2的PBS中測定。檢測參數如下：初始電位0.1 V、終止電位-0.3 V、掃描速率0.1 V/s、取樣間隔0.001 V、靜置時間2 s。

1.3.5 特異性實驗

參照實驗步驟1.3.2節，分別加入1.0×10-8mol/L AMP和1.0×10-6mol/L的阿莫莫林、四環素、卡那霉素、紅霉素進行特異性檢驗，檢測條件同1.3.4節氧化電流檢測方法所述。

1.3.6 實際樣品處理

為驗證本適配體傳感器的實用性，采用標準加入法來檢測牛奶中的AMP。參照文獻[21]對市售牛奶進行預處理，首先以牛奶為本底配制一定濃度梯度的AMP牛奶樣品，接著加入20%三氯乙酸溶液調節pH值至4.6，于45 ℃條件下沉淀15 min，然后在10 000 r/min離心25 min，最后將得到的上清液用0.22 μm濾膜過濾備用。

1.4 數據處理

實驗數據均采集于CHI620E型電化學工作站，以各優化條件對AMP-適配體競爭反應發生前后適配體傳感器凈電流值ΔI的變化量為依據進行數據分析，公式如下：

ΔI＝I0-IX

式中：I0為適配體傳感器在反應體系中不存在待測AMP參與競爭反應時所測電流值；IX為適配體傳感器在反應體系中存在待測AMP參與競爭反應時所測電流值。

2 結果與分析

2.1 電極修飾表征

采用循環伏發法表征磁性AMP信號探針在電極表面的修飾。圖2為不同電極在0.1 mol/L KCl+1 mmol/L溶液中的循環伏發曲線。如圖2所示，曲線a為裸磁性玻碳電極的CV曲線，呈現明顯的氧化還原特征，表現出可逆的氧化還原行為。曲線b為修飾了磁性AMP信號探針后的電極循環伏發曲線，在磁性作用下，所構成的磁性AMP信號探針被修飾到磁性玻碳電極的檢測表面，形成一層不導電的絕緣核酸、蛋白層，阻礙了電子的傳輸，從而導致氧化還原電流值降低。此現象表明磁性AMP信號探針已成功固定到電極的表面上。

圖2 磁性玻碳電極修飾磁性AMP信號探針前后電化學表征Fig. 2 Electrochemical signal of magnetic glass carbon electrode before and after capturing magnetic AMP signal probe

2.2 反應條件的優化

為提高適配體傳感器的性能，同時達到節約成本、節省時間的目的，對磁性AMP-適配體復合物形成過程中的反應時間、反應pH值、檢測過程中磁性信號探針的使用量、測試過程中底液H2O2及HQ濃度等進行優化。

2.2.1 反應時間的優化

為保證反應體系中的AMP充分競爭獲得AMP適配體形成相應狀態的AMP-適配體復合物，對反應時間為10、20、30、40、50 min和60 min的樣品進行電化學分析，由圖3可知，反應進行前30 min，凈電流值隨時間延長快速增加，于第30分鐘處達到最大值，反應進行30 min后，凈電流值隨時間延長開始呈現緩慢下降趨勢。這表明反應進行第30分鐘時，游離的（待測）AMP可充分競爭獲得反應體系中的適配體，形成較多的游離（待測）AMP-適配體復合物，那么磁性AMP-適配體復合物的數量就會同步減少，影響磁性AMP信號探針形成量，從而獲得較高的凈電流值。因此，選定最優反應時間為30 min。

圖3 反應時間對凈電流的影響Fig. 3 Effect of reaction time on ΔI

2.2.2 反應pH值的優化

圖4 反應pH值對凈電流的影響Fig. 4 Effect of pH value on ΔI

測定不同pH值條件下樣品的電化學信號，由圖4可知，隨著pH值的升高，適配體傳感器檢測的凈電流值也在增加，在pH 8.0時凈電流值最大。繼續升高pH值時，凈電流值反而急速下降。這表明pH值對不同狀態AMP-適配體復合物的形成影響較大，當pH 8.0時，適配體結構中的活性結合位點增加[22]，有助于游離（待測）AMP-適配體復合物形成，產生較高的凈電流值。而pH值過大或者過小都會影響適配體結構中結合位點的活性，導致游離（待測）AMP-適配體復合物數量的減少，產生較低的凈電流值。因此，選定AMP-適配體競爭反應的最優pH值為8.0。

2.2.3 磁性信號探針使用量的優化

電化學檢測過程中，適量磁性信號探針的使用可以提高適配體傳感器的靈敏度，同時還能保證其不造成浪費。因此，需要對檢測過程中磁性信號探針的使用量進行優化。實驗中依次將10、30、50、100 μg和150 μg磁性信號探針磁吸固定于處理過的工作電極檢測表面，通過電化學工作站對凈電流值進行檢測分析。由圖5可知，隨著磁性信號探針使用量的增加，凈電流值快速增大，在50 μg處達到最大值。當繼續增加磁性信號探針使用量時，凈電流值反而呈現逐步下降趨勢。這表明隨著磁性信號探針使用量的增加，磁性電極表面的有效吸附區域正被逐步覆蓋，在50 μg使用量時達到飽和，之后繼續增加磁性信號使用量反而使探針相互堆積，電子傳輸速率受到影響，導致凈電流值減弱。因此，磁性信號探針的最優使用量為50 μg。

圖5 磁性信號探針使用量對凈電流的影響Fig. 5 Effect of the amount of magnetic signal probe on ΔI

2.2.4 檢測條件的優化

圖6 檢測體系中H2O2濃度對凈電流的影響Fig. 6 Effect of H2O2 concentration on ΔI

圖7 檢測體系中HQ濃度對凈電流的影響Fig. 7 Effect of HQ concentration on ΔI

檢測H2O2濃度對凈電流值的影響，如圖6所示，H2O2濃度在0.5 mmol/L時，凈電流值達到最大值，所以H2O2最優濃度為0.5 mmol/L。同時，以相同的實驗方法，檢測HQ濃度對凈電流值的影響。如圖7所示，HQ濃度在0.5 mmol/L時，凈電流值最大，其余濃度條件下的凈電流值雖有變化，但都遠小于0.5 mmol/L時的凈電流值。因此，HQ最優濃度為0.5 mmol/L。

2.3 AMP的定量檢測結果

在最優實驗條件下，采用本傳感檢測方法對不同AMP濃度梯度為的樣品進行測定。如圖8所示，其氧化電流值隨著待測樣品中AMP濃度的降低而升高。以樣品濃度的對數為橫坐標，競爭前后的凈電流值為縱坐標作圖，結果顯示該適配體傳感器在AMP含量為1.0×10-12～1.0×10-8mol/L的濃度梯度范圍內存在良好的線性關系，線性回歸方程為：ΔI/μA=2.239 8+0.171 9 lgCAMP，R2=0.995 4，檢出限為1.0×10-12mol/L。該適配體傳感器檢測法與文獻報道的AMP檢測法相比，有較低的檢測限和較寬的檢測范圍（表1）。此外，將制備好的適配體傳感器置于4 ℃條件下避光保存，在最優實驗條件下，每隔1 d對濃度為1.0×10-9mol/L的AMP進行電化學檢測，以檢測該適配體傳感器的穩定性。在1.0×10-9mol/L AMP條件下，線性掃描伏發法測定結果的日內精密度為1.51%，日間精密度為3.30%。上述結果表明，放置一段時間的適配體傳感器檢測效果與最初制備的適配體傳感器檢測效果差異不大，具有良好的穩定性（7 d）。

圖8 適配體傳感器在不同AMP濃度下的線性掃描伏安法掃描圖Fig. 8 Linear sweep voltammetry analysis of the aptasensor with different AMP concentrations

表1 本實驗適配體傳感器與其他檢測方法比較Table 1 Comparison of the developed method with other detection methods

2.4 方法特異性

為驗證該適配體傳感器的特異性，排除實際樣品檢測中可能遇到的其他族類或結構類似抗生素的干擾，分別加入1.0×10-8mol/L AMP，1.0×10-6mol/L的阿莫莫林、四環素、卡那霉素和紅霉素反應進行電化學信號測定。如圖9所示，當檢測體系中存在1.0×10-8mol/L的AMP時，凈電流值明顯最高，但是當檢測體系中的AMP由1.0×10-6mol/L的其他抗生素替代時，凈電流值都明顯偏低。由此表明，本實驗構建的適配體傳感器對AMP具有較高的特異性。

圖9 適配體傳感器特異性分析Fig. 9 Specificity analysis of the aptasensor

2.5 牛奶樣品檢測結果

取購自超市的新鮮純牛奶，按照1.3.6節方法進行預處理后，對其進行加標回回實驗，加標回回率為95.24%～101.30%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）不大于4.38%（n=5）。結果表明：該電化學適配體傳感檢測方法準確可靠，可用于實際牛奶樣品中AMP含量的測定（表2）。

表2 牛奶樣品中AMP的檢測結果Table 2 Recoveries and precision for ampicillin in spiked milk sample

3 結 論

以羧基納米磁磁為載體，適配體與AMP特異性結合為基礎，構建AMP電化學適配體傳感器。采用碳二亞胺交聯法制備了修飾有AMP的磁磁，并以其為磁性識別探針，與待測樣中AMP共同競爭反應體系中的適配體和辣根過氧化物酶，隨后利用磁性電極將上述磁磁（磁性信號探針）吸附于電極檢測表面進行電化學測定。對影響適配體傳感器性能的參數，如競爭反應時間和反應pH值、磁性信號探針使用量、測試底液中H2O2和HQ濃度等進行了優化。確定最佳競爭反應時間為30 min，反應pH值為8.0，磁性信號探針使用量為50 μg，測試底液中H2O2和HQ濃度均為0.5 mmol/L。在最佳條件下，該適配體傳感器在AMP濃度為1.0×10-12～1.0×10-8mol/L梯度范圍內存在良好的線性關系，檢測限可達1.0×10-12mol/L，具有較低的檢測限和較寬的檢測范圍。通過加標回回實驗檢測牛奶樣品中的AMP，證明該適配體傳感器可用于牛奶中AMP的高效檢測。