干制大鯢皮膠原蛋白提取工藝優化

周艷華，張鵬飛，李濤，羅慶華，王建文

1. 長沙環境保護職業技術學院（長沙 410004）；2. 湖南湘典食品有限公司（長沙 410031）；3. 湖南省食品質量監督檢驗研究院（長沙 410111）；4. 吉首大學大鯢資源保護與綜合利用湖南省工程實驗室（張家界 427000）；5. 張家界金鯢生物工程股份有限公司（張家界 427000）

隨著中國大鯢（學名Andrias davidianus，簡稱大鯢）的規模化養殖，每年生產商品大鯢約12 000萬 kg，其中有大量大鯢皮作為大鯢加工副產物而被丟棄。據報道，大鯢皮中含有豐富的蛋白質，其粗蛋白含量占大鯢皮干質量的96.46%，大鯢皮中膠原蛋白含量換算成干質量達60.66%，約占大鯢皮中蛋白質總量的62.89%[1]。近年來，有少量關于從濕態大鯢皮中提取膠原蛋白的報道。其中，李莉等[2]優化人工養殖大鯢皮中膠原蛋白的提取工藝，結果表明，大鯢皮膠原蛋白提取率可達66.99%。顧賽麒等[1]提取大鯢皮中酸溶性膠原蛋白和酶溶性膠原蛋白，提取率分別為28.88%和66.99%，結果表明，膠原蛋白的三股螺旋結構較為完整。袁通等[3]優化大鯢皮膠原蛋白提取工藝，結果表明，膠原蛋白提取率可達71.94%。李靜等[4]以膠原蛋白肽提取率為指標，研究高溫高壓對提高大鯢皮膠原蛋白肽提取率的影響，結果表明，在優化的條件下其提取率可達80.76%。金文剛等[5]研究從大鯢皮中提取明膠的工藝條件，其中明膠提取率可達13.76%。目前鮮見從干制大鯢皮中提取膠原蛋白的報道。新鮮濕態大鯢皮水分高，在常溫下保存易滋生細菌致腐爛變質，需采用低溫保存。但低溫保存存在耗能高導致成本高等問題。此外，采用新鮮濕態大鯢皮樣品加工，存在地域性要求高等問題。若異地加工，需采用冷凍車等工具運輸，導致物流成本大大提高。因此，試驗以經干燥粉碎后的大鯢皮為試驗樣品，研究從干制大鯢皮中提取膠原蛋白的最適提取工藝條件。在此基礎上，進一步采用紫外光譜掃描、紅外光譜掃描分析干制大鯢皮膠原蛋白理化性質，旨在為大鯢皮跨地區加工，節約冷凍、運輸等生產加工成本，并為后續大鯢皮膠原蛋白應用研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

大鯢皮（張家界金鯢生物股份有限公司）；羥脯氨酸標準品（美國Sigma公司）；透析袋（上海源葉生物科技有限公司）；胃蛋白酶（1 200 U/g）、乙酸、氫氧化鈉、正丁醇等（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

AR-2140電子分析天平（美國奧豪斯儀器（上海）有限公司）；1-4 LD型冷凍干燥機（德國ALPHA公司）；Avanti J-26 XP冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司）；pHS-3 C型精密pH計（上海雷磁儀器廠）；DK-98-11 A恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；SHA-B水浴恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司）；FYL-C 020 E料理機（九陽股份有限公司）；FW 100萬能粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）；NEXUS-470傅立葉紅外光譜儀（Nicolet Instrument Corp）；UV 1800紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 干制大鯢皮粉末的制備

將大鯢皮去除皮下脂肪，剪成小塊，于50～60 ℃下加熱烘至干。將干制大鯢皮置于粉碎機中粉碎，包裝待用。

1.3.2 干制大鯢皮膠原蛋白的制備

將干制大鯢皮粉末先采用0.1 mol/L NaOH溶液浸泡24 h以去除非膠原蛋白，其間更換1次堿液，用去離子水洗滌至中性后，用體積分數10%正丁醇溶液浸泡24 h以去除脂肪，其間更換1次溶液，用去離子水洗滌至中性[4]。在此基礎上，加入0.5 mol/L乙酸溶液（料液比1∶20 g/mL），于4 ℃下溶脹大鯢皮24 h，組織搗碎，得到大鯢皮勻漿液。加入一定量胃蛋白酶，于4 ℃下酶解。酶解完成后，于100 ℃滅酶10 min，過濾，濾液10 000 r/min冷凍離心10 min得上清液，上清液即為大鯢皮膠原蛋白粗提液。向上清液中加入NaCl鹽析，至NaCl濃度0.9 mol/L，過夜，冷凍離心收集沉淀。沉淀溶于0.5 mol/L乙酸，以0.5 mol/L醋酸透析2 d，用純水透析2 d，透析時每天更換3次透析外液，透析后得到膠原蛋白提取液，冷凍干燥，得大鯢皮膠原蛋白成品，純化后的膠原蛋白呈白色海綿狀。

1.3.3 胃蛋白酶酶解大鯢皮制備膠原蛋白工藝條件單因素試驗

1.3.3.1 酶添加量的確定

以3 000，4 000，5 000，6 000和7 000 U/g（以干制大鯢皮質量計，下同）的胃蛋白酶添加量，于pH 2.0下酶解4 h，測定膠原蛋白提取率，確定胃蛋白酶添加量。

1.3.3.2 酶解pH的確定

其他條件不變，按上述確定的酶添加量，分別選擇pH 1.5，2.0，2.5，3.0和3.5時酶解，測定膠原蛋白提取率，確定最適pH。

1.3.3.3 酶解時間的確定

其他條件不變，按上述確定的酶添加量、pH，分別選擇酶解時間3，4，5，6和7 h時酶解，測定膠原蛋白提取率，確定最適酶解時間。

1.3.4 胃蛋白酶酶解大鯢皮制備膠原蛋白工藝條件正交試驗

在單因素試驗基礎上，以膠原蛋白提取率為指標，對酶添加量、pH和酶解時間3個因素設計L9(33)正交試驗，以確定酶解的最佳工藝條件，各因素及水平表如表1所示。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.5 干制大鯢皮膠原蛋白理化性質的測定

1.3.5.1 干制大鯢皮膠原蛋白紫外光譜掃描

將干制大鯢皮膠原蛋白樣品溶于0.5 mol/L乙酸溶液中，配制1 mg/mL的膠原蛋白溶液，采用紫外-可見分光光度計于波長190～400 nm對其進行掃描，記錄試驗結果。

1.3.5.2 干制大鯢皮膠原蛋白紅外光譜掃描

將干制大鯢皮膠原蛋白樣品與KBr在瑪瑙研缽中混合研磨，手動壓片，置于傅里葉紅外光譜儀中掃描，掃描范圍4 000～400 cm-1，記錄試驗結果。

1.3.6 大鯢皮中膠原蛋白含量的測定

參照GB/T 9695.23—2008進行羥脯氨酸含量測定。膠原蛋白的質量可由其所含的羥脯氨酸質量乘以其換算系數得到[6]。

式中：1.11為羥脯氨酸換算系數。

2 結果與分析

2.1 酶添加量的確定

酶添加量對干制大鯢皮膠原蛋白提取率的影響如圖1所示。干制大鯢皮膠原蛋白提取率隨酶添加量增加而逐漸增強，這是由于隨著酶添加量增加，酶與底物接觸位點增多，反應加劇，提取率提高。但酶添加量大于6 000 U/g時，膠原蛋白提取率增長緩慢，這是由于酶添加量達到一定程度后，胃蛋白酶作用于底物的位點基本反應完全，故膠原蛋白提取率趨于穩定。因此，選用胃蛋白酶添加量6 000 U/g為宜。

圖1 酶添加量對干制大鯢皮膠原蛋白提取率的影響

2.2 酶解pH的確定

酶解液pH對干制大鯢皮膠原蛋白提取率的影響如圖2所示。隨著酶解液pH升高，干制大鯢皮膠原蛋白提取率先升高后下降，酶解液pH 2.0時，膠原蛋白提取率最高。這可能是pH 2.0時，胃蛋白酶活性高，因此膠原蛋白提取率也高。因此，選擇酶解液pH 2.0為宜。

圖2 pH對干制大鯢皮膠原蛋白提取率的影響

2.3 酶解時間的確定

酶解時間對干制大鯢皮膠原蛋白提取率的影響如圖3所示。隨著酶解時間增加，干制大鯢皮膠原蛋白提取率不斷提高，但時間超過6 h后，其提取率趨于平緩。這是由于隨著酶解時間的延長，適用于胃蛋白酶的專一位點已基本反應完畢。因此，選擇酶解時間6 h為宜。

圖3 酶解時間對干制大鯢皮膠原蛋白提取率的影響

2.4 胃蛋白酶酶解大鯢皮制備膠原蛋白工藝條件正交試驗

在單因素基礎上，根據正交試驗因素水平表，以干制大鯢皮膠原蛋白提取率為指標，對酶添加量、酶解pH和時間3個因素設計L9(33)正交試驗，結果如表2所示。

由表2正交試驗極差k值分析結果可知，影響干制大鯢皮膠原蛋白提取率的各個因素的主次關系為：pH＞酶解時間＞酶添加量。從k值和經濟效益綜合考慮，確定最適工藝條件為A2B2C2，即酶添加量6 000 U/g、pH 2.0、酶解時間6 h。驗證試驗表明，在此工藝條件下，大鯢皮膠原蛋白提取率為86.7%。

表2 正交試驗結果

2.5 干制大鯢皮膠原蛋白理化性質的測定結果

2.5.1 干制大鯢皮膠原蛋白紫外光譜掃描

干制大鯢皮膠原蛋白紫外光譜掃描圖如圖4所示。干制大鯢皮膠原蛋白在230 nm左右處出現特征吸收峰，這是Ⅰ型膠原蛋白的特征紫外吸收峰，這個強吸收峰主要包括電子的n→π*和n→σ*躍遷[7]。試驗結果表明提取的干制大鯢皮膠原蛋白為Ⅰ型膠原蛋白。

圖4 干制大鯢皮膠原蛋白的紫外光譜圖

2.5.2 干制大鯢皮膠原蛋白紅外光譜掃描

干制大鯢皮膠原蛋白紅外光譜掃描圖如圖5所示。干制大鯢皮膠原蛋白在酰胺A帶（3 287.86 cm-1）、酰胺B帶（2 956.93 cm-1）、酰胺Ⅰ（1 600～1 700 cm-1）、酰胺Ⅱ（1 500～1 600 cm-1）、酰胺Ⅲ（1 200～1 400 cm-1）均有特征吸收峰，表明提取的干制大鯢皮膠原蛋白其三股螺旋結構較為完整[1,8]。其中，酰胺A帶主要是由N—H伸縮振動和氫鍵的締合體引起的，一般在3 300 cm-1左右[9-10]；酰胺B帶是由CH2不對稱伸縮振動引起。酰胺Ⅰ帶是由C＝O伸縮振動引起的，因其對膠原蛋白三股螺旋結構的變化較為敏感，所以與膠原蛋白的二級結構關系密切[11]。酰胺Ⅱ帶是由C—N伸縮振動和N—H彎曲振動引起的，本質為α-螺旋、β-折疊和無規則卷曲疊加形成吸收帶，同時Arg，Asp，Glu和Tyr側鏈在此區域也有吸收[12]。酰胺Ⅲ帶是由N—H變形引起的，可以證明膠原蛋白三股螺旋結構的存在[13]。此外，位于酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶之間的一系列吸收峰也表明膠原蛋白三股螺旋結構的完整性[14]。

圖5 干制大鯢皮膠原蛋白紅外光譜掃描圖

3 討論

從濕態大鯢皮中提取膠原蛋白存在地域性要求高和物流成本高等問題，限制大鯢皮的開發利用。試驗提出從干制大鯢皮中提取膠原蛋白，并對其提取工藝條件進行優化。大鯢皮皮質致密、粗厚且韌性較強，往往造成膠原蛋白提取率低下。為提高干制大鯢皮中膠原蛋白的提取率，試驗將干制后的大鯢皮粉碎的方式進行預處理，經粉碎后的大鯢皮粉在后續提取中，提高物料與提取溶劑的接觸比表面積，因此膠原蛋白提取率得到提高。此外，在后續預處理過程中進一步創新，將除去雜蛋白和脂肪的大鯢皮采用乙酸溶脹，溶脹后的大鯢皮組織結構膨脹、松散，有利于后續胃蛋白酶的作用，使干制大鯢皮的膠原蛋白提取率進一步得到提高。

現有研究主要是從濕態的大鯢皮中提取膠原蛋白，從干制大鯢皮中提取膠原蛋白還鮮見報道。與從濕態大鯢皮中提取膠原蛋白相比較，從提取率來看，試驗提取率相對較高，這與提取方法創新密切相關；從提取工藝來看，創新了粉碎、勻漿等工藝，因此增大物料與胃蛋白酶接觸的比表面積，所以酶解時間縮短，提取率提高；從提取成本來看，節約濕態大鯢皮冷凍、運輸等生產加工成本，實現大鯢皮資源的跨區域加工；從提取得到的膠原蛋白來看，保留了膠原蛋白的三股螺旋結構，具有膠原蛋白生物活性。在后續研究中，可進一步探究大鯢皮膠原蛋白所具有的獨特生物活性。

4 結論

膠原蛋白是一種天然高分子蛋白質，具有良好的生物相容性、乳化性、保濕性，被廣泛應用于食品、醫藥和化妝品等領域中。試驗首次采用干制大鯢皮為原料，研究干制大鯢皮制備膠原蛋白工藝條件。以膠原蛋白提取率為評價指標，通過單因素試驗法，分別研究胃蛋白酶添加量、酶解pH和時間對大鯢皮膠原蛋白提取率的影響。在單因素試驗基礎上，通過正交試驗法進一步優化大鯢皮提取膠原蛋白的工藝，確定最適工藝條件：酶添加量6 000 U/g、pH 2.0、酶解時間6 h。在此工藝條件下，大鯢皮膠原蛋白提取率為86.7%。將干制大鯢皮膠原蛋白進行紫外光譜和紅外光譜掃描分析，結果表明，試驗中提取的大鯢皮膠原蛋白保留膠原蛋白較為完整的三股螺旋結構，具有生物活性。