溶菌酶和乳鐵蛋白在冷卻牦牛肉涂膜保鮮中的應(yīng)用

劉琨毅，王琪，吉莉莉，王衛(wèi)，張長貴 ，袁華偉 *

1. 宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院五糧液技術(shù)學(xué)院（宜賓 644003）；2. 肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（成都 610106）；3. 宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院（宜賓 644000）；4. 固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（宜賓 644000）

牦牛是中國青藏高原等地的特有畜種，我國大部分地區(qū)均有養(yǎng)殖[1-2]。牦牛肉因其獨(dú)特的口感與優(yōu)良的營養(yǎng)價(jià)值，近年來受到廣大消費(fèi)者的喜愛[3-4]。隨著人民生活水平的不斷提高，消費(fèi)者對于肉產(chǎn)品新鮮度的要求也越來越高[5]。目前，市場上有大量冷卻肉銷售，因其具有鮮肉與凍肉的優(yōu)良特性，且安全衛(wèi)生、營養(yǎng)價(jià)值保存較為完好，深受消費(fèi)者青睞，具有成為肉類產(chǎn)品消費(fèi)主流的趨勢[6]。如何安全有效地延長冷卻肉的保質(zhì)期是一個(gè)亟待解決的問題，已有方法包括冷凍低溫保藏技術(shù)、添加天然保鮮劑技術(shù)、高壓處理技術(shù)、輻射保鮮技術(shù)等[7-8]。各種保鮮方法各具有優(yōu)缺點(diǎn)，其中添加天然保鮮劑具有食用安全、保鮮效果好、操作簡便等優(yōu)勢，成為冷卻肉保鮮技術(shù)研究熱點(diǎn)[9]。

溶菌酶因其具有可使微生物的細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽的酶類，能導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂使細(xì)菌裂解死亡[10-11]。因此溶菌酶具有一定抗菌保鮮作用，應(yīng)用于乳制品、蛋制品、水產(chǎn)類制品、肉類等食品的防腐保鮮中[12-15]。但由于革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁僅內(nèi)壁層的組成成分為肽聚糖，溶菌酶對革蘭氏陰性菌的抗菌作用相對較差[11]。近年來，保鮮劑研發(fā)方向傾向于使用2種或2種以上的天然保鮮劑混合形成復(fù)合天然保鮮劑，如果能配伍成功，則既能擴(kuò)大原單一保鮮劑的作用范圍，還能降低單一保鮮劑作用量，起到更好保鮮效果[16-19]。乳鐵蛋白是一種鐵結(jié)合蛋白，具有殺菌、抗氧化等多種功能[20-21]。Blake等[22]將乳鐵蛋白應(yīng)用到延長肉類貨架期的研究中，取得了不錯(cuò)成效。Farnaud等[23]利用溶菌酶與乳鐵蛋白協(xié)同抑菌作用的機(jī)理，將其應(yīng)用到豬肉制品中，起到較好抑菌效果。

試驗(yàn)將不同濃度溶菌酶結(jié)合乳鐵蛋白添加到可食性涂膜液中，對冷卻牦牛肉進(jìn)行涂膜保鮮處理，研究其對冷卻牦牛肉的保鮮效果，以期延長冷卻牦牛肉貨架期。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

溶菌酶（酶活力5 000 U/mg，南寧龐博生物工程有限公司）；乳鐵蛋白（武漢鑫偉燁化工有限公司）；牦牛肉（宜賓綠源市場）；可溶性淀粉、海藻酸鈉、單甘酯（均為食品級，河南千志商貿(mào)有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

PHs-3c型精密pH計(jì)（上海理達(dá)儀器廠）；BS210S型電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；LDZX-30FA型立式高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療機(jī)械廠）；101C-3B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海市崇明試驗(yàn)儀器廠）；HH-ZK型恒溫水浴鍋（上海衛(wèi)凱儀器設(shè)備有限公司）；微量滴定管（北京青云卓立精密設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 涂膜保鮮劑的制備

準(zhǔn)確稱取可溶性淀粉30 g、海藻酸鈉6 g、單甘酯2 g，在其中加入1 000 mL生理鹽水中后加熱攪拌均勻，配制成涂膜溶液。在85 ℃水浴中攪拌反應(yīng)30 min，使用無菌燒杯分裝待用[24]。根據(jù)試驗(yàn)方案將適量的乳鐵蛋白與溶菌酶倒入盛有無菌涂膜液燒杯中快速攪拌使之溶解，調(diào)節(jié)涂膜保鮮劑溶液的pH待用。

1.3.2 肉樣的處理

對從超市購買到的牦牛肉進(jìn)行冷卻排酸，使其中心溫度降至0～4 ℃。在無菌操作條件下，去掉筋膜及多余的脂肪，并切成具有較規(guī)則形狀且質(zhì)量在25 g左右的肉。

將處理好的肉隨機(jī)分成若干組，分別浸入相應(yīng)的涂膜保鮮液中一段時(shí)間后，取出瀝干1 min，連同空白組（不添加涂膜保鮮液）放入已滅過菌的燒杯中，并用保鮮膜封口后放人0 ℃冰柜中保藏1周。

1.3.3 測定方法及指標(biāo)

表1 牦牛肉感官評分標(biāo)準(zhǔn)

菌落總數(shù)：將保藏1周后的10 g牦牛肉打碎后浸入100 mL蒸餾水中并停留1 min以上，根據(jù)ISO 6887-1-2003制備初懸液后制取10倍稀釋液[25]。選取合適稀釋度的稀釋液涂布于PCA平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，進(jìn)行菌落總數(shù)的計(jì)數(shù)[26-27]。

感官評價(jià)：邀請15名具有感官評價(jià)經(jīng)驗(yàn)的專家與實(shí)驗(yàn)員組成感官評價(jià)小組，在學(xué)院食品與營養(yǎng)品評室內(nèi)完成牦牛肉的感官評價(jià)。參照SB/T 10399—2005[28]及韓冬潔等[29]對牦牛肉感官品質(zhì)的研究方法，從色澤、黏度、組織狀態(tài)、氣味、煮沸后肉湯等5個(gè)方面制訂牦牛肉的感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，如表1所示。

1.3.4 天然復(fù)合涂膜保鮮劑對牦牛肉減菌化處理的單因素試驗(yàn)

溶菌酶濃度對牦牛肉減菌化處理的影響：控制天然復(fù)合涂膜保鮮劑溶液中乳鐵蛋白濃度0.35%，并調(diào)整天然復(fù)合涂膜保鮮劑溶液pH 5.5，考察經(jīng)過涂膜保鮮劑溶液中溶菌酶濃度分別為0.20%，0.25%，0.30%，0.35%，0.40%，0.45%和0.50%處理20 min冷藏保鮮后牦牛肉的菌落總數(shù)及感官評分。

乳鐵蛋白濃度對牦牛肉減菌化處理的影響：控制天然復(fù)合涂膜保鮮劑溶液中溶菌酶濃度0.35%，并調(diào)整天然復(fù)合涂膜保鮮劑溶液pH 5.5，考察經(jīng)過涂膜保鮮劑溶液中乳鐵蛋白濃度分別為0.20%，0.25%，0.30%，0.35%，0.40%，0.45%和0.50%處理20 min冷藏保鮮后牦牛肉的菌落總數(shù)及感官評分。

天然復(fù)合涂膜保鮮劑溶液pH對牦牛肉減菌化處理的影響：控制處理?xiàng)l件為溶菌酶濃度0.35%、乳鐵蛋白濃度0.35%、處理時(shí)間20 min，分別記錄在天然復(fù)合涂膜保鮮劑溶液pH 4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5和7.0時(shí)利用天然復(fù)合涂膜保鮮劑溶液處理牦牛肉冷藏保鮮后的菌落總數(shù)及感官評分。

天然復(fù)合涂膜保鮮劑溶液處理時(shí)間對牦牛肉減菌化處理的影響：控制溶菌酶濃度0.35%、乳鐵蛋白濃度0.35%、溶液pH 5.5，分別記錄經(jīng)天然復(fù)合涂膜保鮮劑溶液處理5，10，15，20，25，30和35 min冷藏保鮮后牦牛肉的菌落總數(shù)及感官評分。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化牦牛肉減菌化處理的工藝條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面法中Box-Benhnken[30]的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以冷藏保鮮后牦牛肉的菌落總數(shù)為指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，確定天然復(fù)合涂膜保鮮劑溶液對牦牛肉減菌化處理的最佳工藝條件。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，采用Origin Pro 10.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)制圖和統(tǒng)計(jì)分析；Design Expert 9.0.3軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 溶菌酶濃度對牦牛肉原料肉減菌化處理的影響

由圖1可知，隨著溶菌酶濃度的增加牦牛肉的菌落總數(shù)隨之降低，溶菌酶濃度0.50%時(shí)，牦牛肉的菌落總數(shù)達(dá)到最低，為4.50±0.04 lg（CFU/g）；但溶菌酶濃度0.40%和0.50%時(shí)，牦牛肉的菌落總數(shù)變化不顯著（p＞0.05）。溶菌酶濃度0.20%～0.45%范圍變化時(shí)，牦牛肉的感官評分隨溶菌酶濃度增加而顯著增加（p＜0.05），最高可到82.7±0.9分；溶菌酶濃度繼續(xù)增加至0.50%時(shí)，牦牛肉的感官評分反而較0.45%時(shí)有所下降，但差異不顯著（p＞0.05）。從降低成本方面考慮，選擇溶菌酶濃度0.35%～0.45%用于后續(xù)響應(yīng)面法試驗(yàn)。

圖1 溶菌酶濃度對菌落總數(shù)的影響

2.1.2 乳鐵蛋白濃度對牦牛肉減菌化處理的影響

乳鐵蛋白濃度的變化對牦牛肉的菌落總數(shù)較溶菌酶更為顯著，如圖1和圖2所示。乳鐵蛋白濃度逐漸升高時(shí)，牦牛肉的菌落總數(shù)則表現(xiàn)出逐漸下降趨勢，牦牛肉菌落總數(shù)在乳鐵蛋白濃度為0.50%時(shí)達(dá)到最低的4.21±0.07 lg（CFU/g），但與乳鐵蛋白濃度0.45%時(shí)相比，無顯著性差異（p＞0.05），如圖2所示。乳鐵蛋白濃度0.20%～0.40%范圍變化時(shí)，牦牛肉的感官評分隨著乳鐵蛋白濃度的升高而增加；乳鐵蛋白濃度繼續(xù)增加，牦牛肉的感官評分有所下降但無顯著性差異（p＞0.05）。因此，選擇乳鐵蛋白濃度0.40%～0.50%用于后續(xù)響應(yīng)面法試驗(yàn)。

圖2 乳鐵蛋白濃度對菌落總數(shù)的影響

2.1.3 天然復(fù)合涂膜保鮮劑溶液pH對牦牛肉減菌化處理的影響

由圖3可知，天然復(fù)合涂膜保鮮劑溶液在pH 4.0～6.0范圍內(nèi)變化時(shí)，牦牛肉菌落總數(shù)隨著pH升高而降低，感官評分則隨著pH升高而增加；天然復(fù)合涂膜保鮮劑溶液在pH 6.0～7.0范圍內(nèi)時(shí)，牦牛肉菌落總數(shù)隨著pH升高而增加，感官評分則隨著pH升高而降低。表明天然復(fù)合保鮮劑溶液在pH 6.0時(shí)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌能力，經(jīng)其處理后的牦牛肉菌落總數(shù)為4.63±0.08 lg（CFU/g），感官評分達(dá)到最高的80.2±0.6分。因此天然復(fù)合涂膜保鮮劑溶液減菌化處理牦牛肉的最適pH在pH 6.0左右。

圖3 溶液pH對菌落總數(shù)的影響

2.1.4 天然復(fù)合涂膜保鮮劑處理時(shí)間對牦牛肉減菌化處理的影響

由圖4可知，天然復(fù)合涂膜保鮮劑溶液處理時(shí)間在30 min之內(nèi)變化時(shí)，牦牛肉的菌落總數(shù)隨著天然復(fù)合涂膜保鮮劑溶液處理時(shí)間的延長而降低，最低可為4.61±0.10 lg（CFU/g）；處理時(shí)間延長至35 min時(shí)，菌落總數(shù)稍有升高，但差異不顯著（p＞0.05）。天然復(fù)合涂膜保鮮劑溶液處理時(shí)間由5 min增加至25 min時(shí)，感官評分也隨增加；但處理時(shí)間繼續(xù)增加，感官評分則有所下降，主要體現(xiàn)在牦牛肉呈現(xiàn)出一些雜味。因此選擇天然復(fù)合涂膜保鮮劑溶液處理時(shí)間20～30 min用于后續(xù)響應(yīng)面法試驗(yàn)。

圖4 處理時(shí)間對菌落總數(shù)的影響

2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以牦牛肉的菌落總數(shù)為指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平的Box-Benhnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其試驗(yàn)方案如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

利用Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的響應(yīng)面，對溶菌酶濃度、乳鐵蛋白濃度、天然復(fù)合涂膜保鮮劑溶液pH、處理時(shí)間4個(gè)因素分析得到試驗(yàn)結(jié)果，如表3所示。

設(shè)溶菌酶濃度、乳鐵蛋白濃度、溶液pH、處理時(shí)間分別為A、B、C、D，以牦牛肉菌落總數(shù)為響應(yīng)值，運(yùn)用Design-Expert 9.0.3軟件對表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，經(jīng)多元回歸擬合后，得到牦牛肉菌落總數(shù)回歸方程為：菌落總數(shù)=3.93-0.10A-0.19B-0.13C-0.10D+0.095AB+0.15AC+0.31AD-0.003BC-0.24BD-0.017CD+0.18A2+0.28B2+0.33C2+0.22D2。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表4可知，經(jīng)過方差分析，由不同試驗(yàn)條件下所得到的菌落總數(shù)回歸方程與響應(yīng)面值之間的關(guān)系模型極顯著（p＜0.01），且失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著（p＞0.05），表明未知因素對冷卻牦牛肉菌落總數(shù)的干擾較小，由此建立的試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢猿浞謹(jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，所得菌落總數(shù)的回歸方程是能反映菌落總數(shù)與減菌化工藝各參數(shù)之間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，即可以利用此回歸方程確定天然復(fù)合涂膜保鮮劑減菌效果的最佳工藝。4個(gè)因素對菌落總數(shù)影響的強(qiáng)弱順序依次為：乳鐵蛋白濃度＞溶液pH＞溶菌酶濃度＞處理時(shí)間。且溶菌酶濃度與處理時(shí)間之間、乳鐵蛋白濃度與處理時(shí)間之間均具有極顯著的交互作用（p＜0.01）。

表4 方差分析

根據(jù)所得的回歸模型及方差分析，得到4個(gè)因素兩兩之間的響應(yīng)面關(guān)系圖，見圖5所示。基于響應(yīng)面關(guān)系圖所反映的各個(gè)因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系及兩因素間交互作用的類型，可以優(yōu)化冷卻牦牛肉試驗(yàn)條件[31-34]。根據(jù)響應(yīng)面圖曲面坡度越陡峭兩因素交互影響越大的原則[35-39]，由圖5可知，因子A（溶菌酶濃度）與因子D（處理時(shí)間）之間、因子B（乳鐵蛋白濃度）與因子D（處理時(shí)間）之間所形成的響應(yīng)面曲面坡度在6個(gè)響應(yīng)面圖中最為陡峭，因此認(rèn)為因子A與因子D之間、因子B與因子D之間具有很強(qiáng)的交互作用。該結(jié)果與表4方差分析所得的溶菌酶濃度與處理時(shí)間之間、乳鐵蛋白濃度與處理時(shí)間之間均具有極顯著的交互作用（p＜0.01）的結(jié)論相吻合。

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析確定天然復(fù)合涂膜保鮮劑溶液對牦牛肉最佳減菌化工藝為：溶菌酶濃度0.371%、乳鐵蛋白濃度0.492%、溶液pH 6.01、處理時(shí)間28.68 min。此條件下算出理論值為3.797 lg（CFU/g）。對優(yōu)化條件進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn)，得牦牛肉菌落總數(shù)為3.77±0.13 lg（CFU/g）。

經(jīng)測定未使用天然復(fù)合涂膜保鮮劑的牦牛肉（對照組）的菌落總數(shù)為6.91 lg（CFU/g），使用天然復(fù)合涂膜保鮮劑溶液最佳減菌化工藝處理后牦牛肉的菌落總數(shù)為3.77 lg（CFU/g），較對照組下降了45.4%，且符合SB/T 10399—2005牦牛肉[28]菌落總數(shù)應(yīng)低于6.00 lg（CFU/g）的相關(guān)要求。經(jīng)最佳減菌化工藝處理并冷卻保藏1周后，可獲得感官評分為90.8分的牦牛肉。達(dá)到在牦牛肉中添加天然復(fù)合涂膜保鮮劑抑制冷卻過程中微生物的生長且對牦牛肉感官品質(zhì)的影響不顯著的目的[40]。

圖5 兩因素交互作用對菌落總數(shù)的響應(yīng)面圖

3 結(jié)論

基于響應(yīng)面法對利用天然復(fù)合涂膜保鮮劑來抑制牦牛肉中微生物生長的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并確定其最優(yōu)工藝條件為：溶菌酶濃度0.371%、乳鐵蛋白濃度0.492%、溶液pH 6.01、處理時(shí)間28.68 min。此條件下可獲得感官評分為90.8分的牦牛肉，其菌落總數(shù)可降為3.77 lg（CFU/g）。