酶解海帶蛋白制備抗菌肽的工藝優化

吳承燕，蘇羽航，王艷君，劉冬梅，王靖

福建師范大學福清分校，食品軟塑包裝技術福建省高校工程研究中心，近海流域環境測控治理福建省高校重點實驗室（福清 350300）

抗菌肽（Antibacterial peptide）又稱抗微生物肽（Antimicrobial peptide），是一類具有抗菌活性的多肽，已在細菌、真菌、兩棲類、昆蟲、高等植物、哺乳動物甚至人類中發現并分離，對細菌具有廣譜高效的殺菌活性[1]?？咕姆肿恿啃?，不易產生耐藥性，可用于農業、醫藥、食品等行業[2]。

海帶屬于褐子綱海帶目海帶科海帶屬，味道鮮美，營養價值高。近年來，對海帶活性物質的酶解提取多集中在海帶多糖、甘露醇、膳食纖維以及碘等方面[3-7]，而對海帶蛋白以及活性肽的報道較少。李偉等[8]發現海帶蛋白對大腸桿菌、產氣桿菌、金黃色葡萄球菌具有抑制作用，并對高血壓模型大鼠有一定的降壓作用。蔡瑾[9]發現海帶提取物對密執安棒形桿菌環腐亞種有抑菌作用。孟然[10]發現海帶酶解物具有輔助降血糖、抗氧化和降血脂效果。溫志鵬等[3]利用復合蛋白酶水解海帶蛋白提取鮮味成分。

試驗以pH、酶底比、酶解時間及酶解溫度為影響因子，以大腸桿菌為指示菌，探究海帶抗菌肽的抑菌效果，并在單因素試驗的基礎上，采用響應面法優化海帶抗菌肽的制備工藝，為海帶的深加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、儀器與設備

海帶蛋白、大腸桿菌（福建師范大學福清分校實驗室保存）；堿性蛋白酶（南京奧多福尼生物科技有限公司）；牛肉膏（北京奧博星生物技術有限責任公司）；蛋白胨（北京奧博星生物技術有限責任公司）；瓊脂；十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

YP 402 N電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；DK-S 24電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；H-1850 R高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；LDZX-50 KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；SPX-150 B-Z生化培養箱（上海博業有限公司）；FD-IE臺式冷凍干燥機（福州伍聯醫療器械有限公司）；SW-C 5-1 FD雙人垂直超凈工作臺（福州伍聯醫療器械有限公司）；T 22 SP紫外可見分光光度計（上海棱光）。

1.2 堿性蛋白酶酶解海帶蛋白

海帶蛋白的制備參考吳鳳娜等[11]的方法，并加以改進，凍干保存。取一定量的海帶蛋白凍干粉溶于一定pH的磷酸鈉緩沖液中，置于相應溫度的恒溫水浴鍋中預熱，加入堿性蛋白酶。酶解一定時間后95 ℃滅酶15 min，冷卻至室溫，于4 ℃、以12 000 r/min離心10 min，用0.22 μm濾膜過濾除菌后得到抗菌肽溶液，真空冷凍干燥保存備用。

1.3 抑菌率的測定

凍干粉溶于超純水中，配制成質量濃度為1 mg/mL的抗菌肽溶液，抑菌率測定的方法參考姜太玲等[12]的方面，并進行一定的修改。

大腸桿菌活化后，挑取單菌落接種于5 mL牛肉膏蛋白胨培養基中，在37 ℃、180 r/min搖床中培養10 h后，按1∶20擴大培養，4 h后菌懸液濃度約為107CFU/mL。取4支滅菌試管，編號為a、b、c和d，4支試管分別加入200 μL菌懸液，a管和b管各加入1 mL超純水，c管和d管各加入1 mL抗菌肽溶液。其中a管和c管置于4 ℃作空白對照，b管和d管置于37 ℃恒溫培養，24 h后測定600 nm下吸光度A。每組試驗各進行3次，取平均值。

1.4 單因素試驗設計

1.4.1 酶解pH對海帶抗菌肽抑菌率的影響

底物質量濃度為1 mg/mL，在酶底比為5%、酶解時間為4 h、酶解溫度為45 ℃的條件下，pH分別為7，8，9，10，11和12時測定對大腸桿菌的抑菌效果，考察酶解pH對海帶抗菌肽抑菌率的影響。

1.4.2 酶底比對海帶抗菌肽抑菌率的影響

底物質量濃度為1 mg/mL，在酶解時間為4 h、酶解溫度為45 ℃、pH為11的條件下，酶底比分別為2.5%，5%，7.5%，10%和12.5%時測定對大腸桿菌的抑菌效果，考察酶底比對海帶抗菌肽抑菌率的影響。

1.4.3 酶解時間對海帶抗菌肽抑菌率的影響

底物質量濃度為1 mg/mL，在酶底比為5%、酶解溫度為45 ℃、pH為11的條件下，酶解時間分別為2，3，4，5和6 h，考察酶解時間對海帶抗菌肽抑菌率的影響。

1.4.4 酶解溫度對海帶抗菌肽抑菌率的影響

底物質量濃度為1 mg/mL，在酶底比為5%、酶解時間為4 h、pH為11的條件下，酶解溫度分別為35，40，45，50和55 ℃，考察酶解溫度對海帶抗菌肽抑菌率的影響。

1.5 響應面試驗優化設計

在單因素試驗的結果上，在pH 11的條件下，選取酶解時間、酶解溫度、酶底比三個因素為自變量，以對大腸桿菌抑菌率為響應值，采用Box-Behnken設計原理進行響應面分析，并根據最佳條件進行驗證試驗。選取的因素水平及編碼如表1所示。

表1 響應面試驗因素和水平

1.6 數據處理

試驗數據采用Origin軟件和Design Expert軟件進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶解pH對海帶抗菌肽抑菌率的影響

不同pH對抑菌率的影響如圖1所示。隨著pH的升高，抗菌肽對大腸桿菌的抑菌率呈現先增加后降低的趨勢，這與堿性蛋白酶的最適pH范圍相符。pH過高或過低，都會影響堿性蛋白酶活性中心的構象，從而影響其與底物的結合，使酶與底物易于解離。在pH 11時抑菌效果最佳，抑菌率達到最大值，因此后續優化試驗選擇pH 11進行。

圖1 pH對抑菌率的影響

2.1.2 酶底比對海帶抗菌肽抑菌率的影響

不同酶底比對抑菌率的影響如圖2所示。當底物質量濃度保持1 mg/mL不變時，隨著堿性蛋白酶的增加，抑菌效果逐漸增強，在酶底比為10%時達到最大值，之后略有下降。酶濃度低，不足以讓海帶蛋白完全酶解，發揮其抗菌活性；加酶量過高，酶解反應速度過快，可能將部分多肽酶解成更小的肽段，喪失其抗菌活性。因此，控制酶底比7.5%，10%和12.5%進行優化試驗。

2.1.3 酶解時間對海帶抗菌肽抑菌率的影響

不同酶解時間對抑菌率的影響如圖3所示。抑菌率隨時間增加而緩慢增加，在5 h時達到最大值，之后抑菌效果下降。酶解時間太短，可能某些具有抑菌活性的氨基酸殘基尚未暴露出來，無法充分發揮功能。酶解時間過長，抗菌肽被降解，導致抑菌率降低。因此，選擇4，5及6 h作為優化試驗的三個水平。

圖2 酶底比對抑菌率的影響

圖3 酶解時間對抑菌率的影響

2.1.4 酶解溫度對海帶抗菌肽抑菌率的影響

不同酶解溫度對抑菌率的影響如圖4所示。曲線呈現先上升后下降的趨勢。酶解溫度較低，未達到分子活化溫度，酶與底物碰撞概率較低，底物被酶解的概率也相應較低；溫度過高，雖然分子熱運動速度增快，但酶內的一些次級鍵發生斷裂，導致結構變化，影響催化效率。因此優化試驗的酶解溫度可選擇35，40和45 ℃。

圖4 酶解溫度對抑菌率的影響

2.2 響應面試驗結果

利用Design Expert軟件對表2數據進行分析和處理，得到抑菌率與酶解時間（A）、酶解溫度（B）和酶底比（C）的二次回歸模型：Y=-29.29-0.76A+0.90B-2.45C+1.01AB+1.73AC+0.77BC-3.26A2-4.48B2-1.60C2?；貧w分析與方差分析結果如表3所示。該模型p＜0.000 1，表明具有極顯著性，失擬項p=0.571 4＞0.05，表明模型的失擬項不顯著，R2=98.25%，R2Adj=96.00%，表明模型與試驗擬合良好，可以用此模型對抗菌肽抑菌效果進行分析和預測。影響抑菌率的各因素主次順序為C＞B＞A。一次項中A、B影響顯著，C影響極顯著，二次項中BC影響不顯著，AB影響顯著，AC、A2、B2、C2影響極顯著。

表2 響應面分析試驗設計與結果

表3 回歸模型顯著性檢驗及方差分析

各交互作用對抑菌率的影響如圖5～圖7所示。響應面曲面坡度的陡峭或平緩程度反映出海帶抗菌肽抑菌效果響應值的靈敏度。從曲面的坡度可知，酶解時間與酶底比、酶解時間與酶解溫度交互作用明顯，酶解溫度與酶底比交互作用不明顯，這與表3中的結果相符。

利用響應面法優化出海帶抗菌肽制備的最佳工藝為酶解時間4.62 h、酶解溫度39.86 ℃、酶底比7.55%，此條件下抑菌率的理論值為30.62%。鑒于試驗操作的便利性，調整酶解時間為4.6 h、酶解溫度為39.9 ℃、酶底比為7.6%，在此條件下進行3次平行驗證試驗，測得抑菌率的平均值為30.14%，與預測結果相差1.6%，說明采用響應面法優化海帶抗菌肽制備的工藝條件準確可靠，通過試驗所建立的模型可用于實際應用。

圖5 酶解時間與酶解溫度對抑菌率的影響

圖6 酶解時間與酶底比對抑菌率的影響

圖7 酶解溫度與酶底比對抑菌率的影響

3 結論與討論

試驗以海帶蛋白為原料，通過單因素試驗與Box-Behnken響應面試驗優化堿性蛋白酶酶解制備抗菌肽的工藝，預測得到的最佳參數為酶解時間4.6 h、酶解溫度39.9 ℃、酶底比7.6%。在pH 11、底物質量濃度1 mg/mL的條件下，3次驗證試驗的平均值為30.14%，與預測值30.62%接近，表明采用響應面法具有一定的可行性。

試驗僅以大腸桿菌為指示菌，后續工作會繼續評價對其他細菌、真菌的抑菌效果，并對酶解產生的多肽成分進行分離純化，通過結構測定確定其抗菌機理。在此試驗基礎上，可開發海帶抗菌肽在食品、醫藥領域的應用，并為海帶的加工利用提供新參考。