水蒸氣蒸餾法提取澳洲堅果葉精油工藝

何鳳平，雷朝云，范建新，康專苗，劉榮，韓樹權

貴州省農業科學院亞熱帶作物研究所（興義 562400）

澳洲堅果（Macadamia internifolia）亦稱夏威夷果，為山龍眼科澳洲堅果屬的多年生常綠果樹，原種植于澳大利亞昆士蘭州東南部沿海地區及新南威爾士州東北部沿岸的亞熱帶雨林地區[1-2]。目前，澳大利亞、南非、美國、中國等為其主要栽培國家，在我國的廣東、云南、廣西、貴州、四川等地均有種植[2-3]。近年來，澳洲堅果發展十分迅猛，應用前景相當廣闊，吸引眾多國內外學者在栽培和品質方面作了深入的研究，然而集中于澳洲堅果其他方面的國內外研究相當少，尤其是枝葉方面的報道更是微乎其微，當前僅有的少數研究均是關于其葉面積的測定[4-6]。

目前，貴州省乃至全國各地均是將澳洲堅果枝葉修剪之后丟棄在地，任其腐爛當作自身的肥料或是回收至家焚燒取暖，既污染空氣，又未發揮出它自身的最大價值，嚴重不符合可持續發展的理念。有前期試種研究發現，貴州省南北盤江、紅水河流域海拔1 000 m以下、赤水河流域海拔650 m以下等地區均適宜種植澳洲堅果，貴州適宜種植面積在9.87萬 hm2以上，種植推廣空間巨大[7]。目前貴州現有澳洲堅果栽培面積約1 333 hm2，全國13.33萬 hm2以上，每年修剪遺棄的澳洲堅果葉片不計其數。隨著產業的不斷發展，意味著修剪遺棄掉的澳洲堅果葉片將越來越多，急需為修剪遺棄的澳洲堅果葉尋找出路，做出適宜處理以使它價值最大化，從而變廢為寶。

精油是存在于植物體內（如：花、果實、葉、根、皮等）的一類可隨水蒸氣蒸餾且具有一定氣味的揮發性油狀液體的總稱，屬植物體自身的次級代謝產物，享有“液體黃金”的美譽。國內外眾多的研究均表明，植物精油是由多種成分組合的天然混合物，具有抗氧化、抑菌、保鮮等作用，廣泛應用于化妝品、洗滌用品、食品（果蔬及肉類）、煙酒以及其他工業用香精中[8-15]。目前植物精油提取方法有很多，例如水蒸氣蒸餾法、分子蒸餾法、同時蒸餾萃取法、有機溶劑萃取法、超臨界二氧化碳流體萃取法、亞臨界水萃取法、微膠囊-雙水相萃取法、超聲微波輔助提取法等[8,16-17]，其中水蒸氣蒸餾法因設備簡單、操作簡便、提取成本低等優點應用廣泛，同時也是植物精油提取最為常用的方法[18-19]。

迄今國內外有大量植物精油相關的研究報道，但其中卻鮮有關于澳洲堅果葉片提取精油的報道。前期預試驗發現能從澳洲堅果葉片中提取出精油，但方法還需要不斷改進和優化，從而達到變廢為寶、提高澳洲堅果附加值的目的，進一步促進澳洲堅果產業健康綠色發展。因此，研究通過單因素試驗（浸泡時間、料液比、NaCl質量濃度和蒸餾時間）和正交試驗來確定水蒸氣蒸餾法提取澳洲堅果精油的最佳工藝條件，旨在為澳洲堅果葉的相關研究提供理論參考及依據，同時對于澳洲堅果葉的開發利用也具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

澳洲堅果鮮葉，采摘于貴州省農業科學院亞熱帶作物研究所基地，根據葉片的色澤及形態挑選成熟的葉片采摘。

NaCl，購自成都金山化學試劑有限公司，分析純；無水乙醇，購自天津市富宇精細化工有限公司，分析純。

蒸餾裝置（1 000 mL）；JM-B 5003型電子天平，余姚紀銘稱重校驗設備有限公司；艾柯超純水機，成都唐氏康寧科技發展有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 前處理方法

將采摘的澳洲堅果鮮葉運回實驗室，挑選新鮮、無病蟲害的葉片洗凈，自然晾干葉片表面水分待用。精油提取之前去掉葉片的葉柄，然后剪成1～2 cm2的碎片備用。

1.2.2 提取方法

澳洲堅果鮮葉精油提取采用水蒸氣蒸餾法，以《中華人民共和國藥典》中揮發油提取方法為參照[20]。準確稱取澳洲堅果碎葉片50.00 g，裝入到1 000 mL的圓底燒瓶中，然后按照試驗設計中的料液比加入蒸餾水，改變浸泡時間、NaCl質量濃度和蒸餾時間，連接好蒸餾裝置開始進行不同條件下的蒸餾。第一滴液滴滴出時開始計時，蒸餾結束之后，采用油水分離器分離精油，收集精油稱質量，計算精油提取率。

1.2.3 精油提取率計算

1.2.4 單因素試驗設計

1.2.4.1 浸泡時間對澳洲堅果精油提取率的影響

準確稱取5份澳洲堅果碎葉片50.00 g，分別按照1∶5（g/mL）的料液比加入2.5 g/100 mL的NaCl溶液，在室溫條件下浸泡0，2，4，6和8 h，蒸餾提取2 h之后，采用油水分離器分離精油，收集精油稱質量，計算精油提取率，確定澳洲堅果精油提取的最理想浸泡時間。

1.2.4.2 料液比對澳洲堅果精油提取率的影響

準確稱取5份澳洲堅果碎葉片50.00 g，分別按照1∶3，1∶4，1∶5，1∶6和1∶7（g/mL）的料液比加入2.5 g/100 mL的NaCl溶液，在室溫條件下浸泡2 h，蒸餾提取2 h之后，采用油水分離器分離精油，收集精油稱質量，計算精油提取率，確定澳洲堅果精油提取的最佳料液比。

1.2.4.3 NaCl質量濃度對澳洲堅果精油提取率的影響

準確稱取5份澳洲堅果碎葉片50.00 g，分別按照1∶5（g/mL）的料液比加入0，2.5，5，7.5和10 g/100 mL的NaCl溶液，在室溫條件下浸泡2 h，蒸餾提取2 h之后，采用油水分離器分離精油，收集精油稱質量，計算精油提取率，確定澳洲堅果精油提取的最適宜NaCl質量濃度。

1.2.4.4 蒸餾時間對澳洲堅果精油提取率的影響

準確稱取5份澳洲堅果碎葉片50.00 g，分別按照1∶5（g/mL）的料液比加入2.5 g/100 mL的NaCl溶液，在室溫條件下浸泡2 h，蒸餾提取1，2，3，4和5 h之后，采用油水分離器分離精油，收集精油稱質量，計算精油提取率，確定澳洲堅果精油提取的最合適蒸餾時間。

1.2.5 正交試驗設計

以澳洲堅果精油提取率為指標，在單因素試驗基礎上，選取料液比、NaCl質量濃度和蒸餾時間作為主要因素設計正交試驗，確定澳洲堅果精油提取的最佳工藝條件。正交試驗因素水平設計表見表1。

表1 澳洲堅果葉精油提取正交試驗因素水平設計表

1.2.6 澳洲堅果精油最佳提取工藝條件驗證

在正交試驗中得出的最佳提取工藝條件下，按照1.2.2項中的方法進行精油提取，重復5次，計算澳洲堅果葉精油提取率平均值，與正交試驗中的精油提取率最大值進行比較，驗證正交試驗是否有效。

1.2.7 數據分析及處理

各指標測定均重復3次。運用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進行數據處理及分析，Sigma Plot 12.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 浸泡時間對澳洲堅果葉精油提取率的影響

由圖1可知，浸泡時間對澳洲堅果葉精油提取率的影響效果不太明顯，在其他條件一定的情況下，隨著浸泡時間的延長，澳洲堅果葉精油提取率增加幅度不大。在浸泡2 h之后，精油提取率還存在稍微降低的趨勢，可能原因在于浸泡時間過長，澳洲堅果葉中部分精油也許會溶于水中，另外或許是因為澳洲堅果葉中某些能產生乳化作用的成分溶出而抑制精油被蒸出，最終導致其精油提取率降低[21-23]。因此，綜合精油提取率、時間成本等因素，選擇浸泡時間2 h為宜。

2.1.2 料液比對澳洲堅果葉精油提取率的影響

在植物精油提取中，料液比是一個較為重要的影響因素。由圖2可知，隨著料液比增加，澳洲堅果葉精油提取率逐漸上升，在料液比為1∶5（g/mL）時，澳洲堅果葉精油提取率達到最大值，原因在于：一是隨著料液比的增加，蒸汽釋放速率會提高，從而對精油的攜帶能力會增強，致使精油提取率增大[24]；二是對于固定質量的原料來講，添加進去的水量增多，精油濃度會隨之降低，使得精油與水接觸面處的濃度差反而會增大，可提髙傳質速率，同時還能讓原料得到充分地浸泡，細胞更容易破裂，精油也更易滲透出來，從而可在一定程度上增加精油提取率[18,21,25]。當料液比繼續增大，精油提取率卻呈現出緩慢下降的趨勢，主要是由于蒸汽所攜帶出的精油量在增多，而冷凝回收的效率卻在降低[24]。因此，在一定的冷凝效果及固定質量的原料條件下，適宜的料液比對精油提取率有很大的影響，綜合精油提取率、節能等方面考慮，料液比選擇1∶5（g/mL）為宜。

圖1 浸泡時間對澳洲堅果葉精油提取率的影響

圖2 料液比對澳洲堅果葉精油提取率的影響

2.1.3 NaCl質量濃度對澳洲堅果葉精油提取率的影響

NaCl在整個蒸餾過程中主要起到鹽析的作用[26]。在水蒸氣蒸餾法提取植物精油過程中，加入適量的NaCl之后，可以極大程度地提高精油提取率，主要是因為一定質量濃度的NaCl溶液可以改變植物組織細胞的滲透壓，促使細胞破裂，讓位于細胞內的精油可以更多地滲透出來，同時NaCl還能降低精油在水中的溶解度，從而使得精油更容易被蒸出[25]。由圖3可知，隨著NaCl質量濃度增加，澳洲堅果葉精油提取率升高，NaCl質量濃度為2.5 g/100 mL時達到最大值；隨后NaCl質量濃度增大，澳洲堅果葉精油提取率反而呈現出不斷下降的趨勢。綜合精油提取率、節能等方面考慮，NaCl質量濃度選擇2.5 g/100 mL較為合理。

圖3 NaCl質量濃度對澳洲堅果葉精油提取率的影響

2.1.4 蒸餾時間對澳洲堅果葉精油提取率的影響

水蒸氣蒸餾法提取植物精油，若蒸餾時間太短，水分將不能充分地浸入到植物組織的各個部位，導致精油不能完全被提取出來，從而使得提取率降低。通過延長蒸餾時間可以更徹底地將精油提出，獲得較為理想的提取效果，但是蒸餾時間若過長，將會浪費掉很多資源，同時在蒸餾后期蒸汽量太大反而還會致使少部分精油損失[24-25]。由圖4可知，隨著蒸餾時間的延長，澳洲堅果葉精油提取率逐漸增大，當蒸餾時間為4 h時，澳洲堅果葉精油提取率達到最大值；隨后呈降低的趨勢。綜合精油提取率、節約能耗及時間成本等方面考慮，蒸餾時間宜選擇4 h。

圖4 蒸餾時間對澳洲堅果葉精油提取率的影響

2.2 澳洲堅果葉精油提取工藝的正交試驗結果及方差分析

由各因素的單因素試驗結果得知，料液比、NaCl質量濃度和蒸餾時間對澳洲堅果葉精油提取率的影響最大，由此確定料液比、NaCl質量濃度和蒸餾時間為影響澳洲堅果精油提取率的主要因素，為確定其最佳提取工藝條件，設計了正交試驗。以精油提取率為指標，進行L9(34)正交試驗，得出水蒸氣蒸餾法提取澳洲堅果葉精油的最佳工藝條件，其中加入空白列的目的在于能更好地檢驗是否存在對試驗結果有重要影響的因子被遺漏[18]。

極差R越大表明該因素對精油提取率的影響就越大[18]。從表2中可知，極差分析結果顯示RA＞RC＞RB，由此可得知各因素對澳洲堅果葉精油提取率影響程度大小排序為A＞C＞B，即料液比＞蒸餾時間＞NaCl質量濃度。正交試驗結果中的提取率越大表明精油提取效果越好，以澳洲堅果葉精油提取率為指標，選擇k1、k2、k3中最大值對應的水平為最佳提取工藝因素水平。綜合分析得出，水蒸氣蒸餾法提取澳洲堅果葉精油的最佳工藝條件為A3B2C2或A3B2C3，由于考慮成本因素，選擇A3B2C2，即料液比1∶5（g/mL）、NaCl質量濃度2.5 g/100 mL、蒸餾時間3 h。

表2 澳洲堅果葉精油提取工藝的正交試驗結果及極差分析表

澳洲堅果葉精油正交試驗效應曲線見圖5。圖中各因素對提取率影響變化趨勢同單因素試驗中基本一致。

圖5 澳洲堅果葉精油正交試驗效應曲線

2.3 澳洲堅果葉精油提取工藝條件驗證結果

為考察上述最佳工藝條件的穩定性，按照正交試驗得出澳洲堅果葉精油的最佳提取條件：料液比1∶5（g/mL）、NaCl質量濃度2.5 g/100 mL、蒸餾時間3 h、重復5次。計算得出精油提取率平均值為1.061%，與正交試驗中的精油提取率最大值1.067%極為接近，說明正交優化試驗有效。

表3 澳洲堅果葉精油提取工藝條件驗證結果表

3 結論

研究中，在單因素試驗基礎上，進行了正交試驗，綜合單因素試驗結果和正交試驗結果，分析得到水蒸氣蒸餾法提取澳洲堅果葉精油的最佳工藝條件為料液比1∶5（g/mL）、NaCl質量濃度2.5 g/100 mL、蒸餾時間3 h。通過極差分析得出，各因素對澳洲堅果葉精油提取率的影響程度大小排序為料液比＞蒸餾時間＞NaCl質量濃度。