多指標綜合分析法優(yōu)化杭白菊水提取工藝

高如意，鄧辰辰，郭小莉，曹苗苗，張理興，柏偉榮

1. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司（連云港 222047）；2. 中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室（連云港 222047）

菊花為菊科植物菊的干燥頭狀花序。9～11月花盛開時分批采收，陰干或焙干，或熏、蒸后曬干，藥材按產(chǎn)地和加工方法不同，分為亳菊、滁菊、貢菊、杭菊。杭白菊，“浙八味”之一，為浙江桐鄉(xiāng)地區(qū)的特產(chǎn)，杭白菊在中國有悠久的栽培歷史，“杭白貢菊”一向與“龍井名茶”并提。菊花位列衛(wèi)生部公布的藥食同源目錄中，食用安全性高，國家食品藥品監(jiān)督管理局數(shù)據(jù)庫已獲批的保健食品中，使用菊花為原料的產(chǎn)品超過300個，涉及的保健功能很多，包括抗氧化、輔助降血脂、緩解視疲勞等，可見菊花的藥用價值和保健價值都很高。

菊花富含多種活性成分，研究表明菊花中主要含有黃酮、萜類及有機酸等化學(xué)成分[1-3]。關(guān)于菊花主要活性成分提取的研究較多，多為乙醇提取[4-5]，考察的指標為綠原酸或總黃酮單個指標，沒有對總黃酮、綠原酸、多糖進行綜合考察，而且，菊花作為保健食品原料時，多采取傳統(tǒng)水提的方式，水提取工藝有較高的安全性。此外，菊花富含的綠原酸、總黃酮和多糖等多種成分有較好的水溶性，因此，試驗以綠原酸、總黃酮、多糖為指標，采用正交設(shè)計[6-8]方法優(yōu)選杭白菊水提取最佳工藝，為杭白菊在保健食品和普通食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 材料與儀器

UV-2700型紫外分光光度計（日本島津）；高效液相色譜儀（戴安，Agilent，島津）；粉碎機；電熱套；Mili-Q超純水儀（美國密理博公司）。

甲醇、苯、乙醇、硫酸、苯酚（分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司）；乙腈（色譜純）。

杭白菊（浙江，安徽廣印堂中藥股份有限公司，批號Y170311）；綠原酸（含量96.2%，批號110753-201415）、D-無水葡萄糖（含量99.9%，批號110833-201406）、蘆丁（92.6%，批號100080-201609）均為中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 綠原酸檢測方法

選用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑[6-8]，色譜柱為Waters C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30℃、流速1 mL/min，以乙腈-0.5%磷酸為流動相，經(jīng)過調(diào)節(jié)兩者比例，確定比例10∶90時供試品圖譜中綠原酸峰形較好。

對照品溶液的制備：精密稱取4.8 mg綠原酸于100 mL容量瓶，加50%甲醇定容，搖勻，作為母液。

供試品溶液的制備取：本品粉末（過四號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密稱定，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W、頻率35 kHz）30 min，放冷，搖勻，高速離心（12 000 r/min），取上清液，即為供試品。

2.1.1 線性關(guān)系考察

取綠原酸母液，加50%甲醇稀釋配置成一系列濃度（4.829，9.659，19.317，28.976，38.634和48.293 μg/mL）的標準溶液，精密吸取對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積。結(jié)果表明，綠原酸在4.829～48.293 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=3×107x+7×106，R2=0.999 7。

2.1.2 精密度試驗

精密吸取低、中、高3個濃度的對照品溶液和供試品溶液，連續(xù)重復(fù)進樣6次，測得綠原酸峰面積積分值，計算，RSD值均小于2%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性試驗

按2.1的供試品制備方法制備6份供試品，在2.1.1條件下分別進樣，測定峰面積，計算得到RSD為0.48%（n=6），結(jié)果表明該法重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗

按2.1的供試品制備方法制備6份供試品，在2.1.1條件下分別于0，2，4，8，12和16 h各進樣2次，測得綠原酸的峰面積積分值，計算得到綠原酸的峰面積RSD為0.20%，結(jié)果表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 多糖檢測方法

粗多糖的含量按照《保健食品功效成分檢測方法》中“粗多糖的測定方法”（硫酸-苯酚比色法）[9]規(guī)定的方法進行測定。

對照品溶液的制備：取D-無水葡萄糖適量約15.3 mg于100 mL量瓶中，用純化水溶解并定容，制成每1 mL含D-無水葡萄糖0.15 mg的標準溶液，搖勻，即得對照品母液。

供試品溶液的制備：取杭白菊提取液1 mL于50 mL容量瓶中加水定容，搖勻，取5.0 mL移入50 mL離心管中，加入無水乙醇25 mL，4 ℃靜置過夜，離心后留殘渣，并用10 mL 80%的乙醇洗沉淀物（振搖打散沉淀），以4 000 r/min離心10 min，小心棄去上清液，重復(fù)洗沉淀物2次，熱水溶解沉淀后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，冷卻后定容，搖勻，即得。

2.2.1 線性考察

分別精密吸取D-無水葡萄糖母液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.8和1.0 mL于25 mL比色管中，加水至2.0 mL，加入5%苯酚試液1.0 mL，混合均勻后再加濃硫酸10.0 mL，于渦旋混合器中混勻，在沸水浴中加熱2 min，取出置冰水浴中冷卻，得標準系列溶液。于485 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。結(jié)果表明，多糖在1.53～15.39 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.058 1x+0.000 5，R2=0.999 4。

2.2.2 精密度試驗

按2.2.1條件下制作標準曲線，對照品溶液的精密度RSD為0.001 7%，供試品溶液的精密度RSD為0.35%，符合要求，說明儀器精密度好。

2.2.3 重復(fù)性試驗

按2.2的供試品制備方法制備6份供試品，在2.2.1條件下分別進樣，測定吸光度，計算得到RSD為1.65%（n=6），結(jié)果表明此法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗

按2.2.1條件下制備供試品溶液，分別考察0，30，60，120，240和360 min條件下供試品的吸光度，供試品溶液的RSD為0.6%，表明供試品溶液在6 h內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。

2.3 總黃酮檢測方法

檢測方法參考《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范實施手冊》（2003年版）中“保健食品中總黃酮的測定”。

對照品溶液的制備：取蘆丁標準品適量，精密稱定，加甲醇制備成每1 mL含總黃酮58.47 μg的標準品儲備液。取蘆丁標準儲備液（58.47 μg/mL）0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL于10 mL比色管中，加甲醇至刻度，搖勻，于波長360 nm測定吸光度，繪制蘆丁濃度和吸光度的標準曲線。

供試品溶液的制備：取杭白菊提取液1 mL于25 mL容量瓶中，加水定容，吸取1.0 mL，拌入1 g聚酰胺粉，攪拌均勻，70 ℃水浴烘干，聚酰胺粉轉(zhuǎn)入層析柱。用20 mL苯洗脫，棄去苯液，靜置2 h后，待苯液揮干后用甲醇洗脫并定容至25 mL，即得。

2.3.1 線性考察

取蘆丁標準儲備液（47.41 μ g/mL）0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL于10 mL比色管中，加甲醇至刻度，搖勻，于波長360 nm測定吸收值，繪制蘆丁濃度和吸光度的標準曲線。結(jié)果表明，蘆丁在4.74～23.71 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.029 6x-0.008 3，R2=0.999 5。

2.3.2 精密度試驗

取標準品溶液（質(zhì)量濃度9.482 0 μg/mL）于360 nm處測定吸光度，分別讀取6次，標準品溶液的精密度RSD為0.14%，符合要求，說明儀器精密度好。

2.3.3 重復(fù)性試驗

按2.3的供試品制備方法制備6份供試品，在2.3.1條件下分別進樣，測定吸光度，計算得到RSD為0.48%（n=6），結(jié)果表明此法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品，按照重復(fù)性方法制備1份供試品溶液在0，30，60，90，120和180 min時在360 nm下測定吸光度，樣品溶液在180 min內(nèi)吸光度無明顯變化，RSD為0.72%，說明該方法穩(wěn)定性好。

2.4 正交試驗設(shè)計

杭白菊里主要活性成分綠原酸、總黃酮和多糖均有較好的水溶性，采用加熱回流提取的方法，可以有效提取多種活性物質(zhì)。參考前人研究，提取的料液比、加熱時間、提取次數(shù)均對活性成分的提取率有較大的影響。因此，選取提取時間、提取溶劑量、提取次數(shù)為考察因素，每個因素選取3個水平，以杭白菊中綠原酸、總黃酮、粗多糖得率的綜合評分為指標，對杭白菊提取工藝進行優(yōu)化。

綜合評價是利用數(shù)學(xué)方法（包括數(shù)理統(tǒng)計方法）[10-12]對一個復(fù)雜系統(tǒng)進行分析處理，是一種對多個指標、多個單位同時進行分析評價的方法。杭白菊里主要成分有多糖、總黃酮和綠原酸，目前菊花中多糖、綠原酸和總黃酮的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究都較多，試驗利用總黃酮、綠原酸和多糖含量的提取率，并根據(jù)指標因素對提取工藝影響的貢獻大小的差異，給予分配不同的權(quán)重系數(shù)，即多糖得率為0.33，綠原酸得率為0.34，總黃酮得率為0.33，再進行加權(quán)求和[13-15]，綜合評分方法如式（1）。

取杭白菊9份，每份200 g，按L9(34)正交表進行試驗，試驗安排及結(jié)果見表1和表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 綜合評分方差分析

由直觀分析可知，各因素作用主次順序為C＞A＞B。方差分析表明，因素C為主要影響因素，具有顯著性差異，因素A、B則無顯著性影響，確定最佳提取工藝條件選擇A2B2C3，即加10倍量水提取2次，每次3 h。

2.5 正交試驗驗證試驗

取6份杭白菊，每份200 g，其中3份分別加水10倍，提取2次，每次1 h；另外3組加水10倍，提取3次，每次1 h，驗證試驗結(jié)果見表4。

從驗證試驗可以看出，提取3次的總黃酮、綠原酸、多糖含量僅略高于提取2次，結(jié)合耗能、時間等因素，選擇提取2次更為經(jīng)濟，在此條件下，多糖提取率為3.7%，綠原酸得率為0.2%，總黃酮提取率為2.3%。

表4 驗證試驗

3 討論

通過單因素試驗確定影響杭白菊中活性成分得率的3個主要因素為：提取次數(shù)＞提取時間＞料液比。其中提取次數(shù)有顯著影響，采用綜合評分的方法對3種活性成分賦權(quán)，運用正交設(shè)計試驗方法得到的最佳提取條件為：加水10倍、提取2次、每次1 h。研究為杭白菊在保健食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考，杭白菊中的多糖能夠起到增強免疫力、降血糖的作用；杭白菊中的綠原酸具有抗菌、解毒、利膽作用；杭白菊中黃酮類化合物不僅具有良好的消除自由基和抗氧化能力，而且具有明顯的降低血脂和防動脈硬化的作用[16-17]，可見，杭白菊中主要活性成分有較好的保健功能。作為保健食品原料時，試驗尚未對杭白菊的濃縮、干燥工藝進行研究，后續(xù)將開展深入研究。