水中銅綠假單胞菌顯色培養基的初步應用

蔣曙光，曹琥靚

1. 上海市營養食品質量監督檢驗站（上海 200082）；2. 上海源本食品質量檢驗有限公司（上海 200082）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）屬于假單胞菌屬，是一類致病性較低但抗藥力強的菌，其普遍分布于自然界中，如泥土中、動植物上、正常人的皮膚上和腸道呼吸道中。

銅綠假單胞菌可以在水環境中生存很長時間，可引起人的腹瀉等疾病，世界衛生組織和我國都將此菌作為瓶裝飲用水的污染危害指示菌，日本和加拿大等國家已經對水的銅綠假單胞菌的存在作出限量規定；國際食品法典委員會（CAC）和歐盟成員國都明確作出了相應的規定，并指出在水中不得檢出此菌[1-2]。因此，銅綠假單胞菌被認為是水源性致病菌，是危害人類健康的一大威脅[3]。

目前國內外檢驗標準中，使用CN假單胞菌選擇性培養基并結合濾膜法是檢測水中銅綠假單胞菌最常用的手段[3]，水樣經過過濾后將濾膜移到CN假單胞菌選擇性培養基上，于36 ℃培養48 h，若在濾膜上有褐色或產有熒光的菌落，需純化培養后進一步生化鑒定，其檢驗過程繁瑣，通常要耗時5～7 d。

針對我國的水質污染情況，為進一步加快和提高檢驗水樣的效率，特別是大量水樣現場檢驗，試驗通過使用銅綠假單胞菌顯色培養基結合濾膜法，24～48 h就可以完成銅綠假單胞菌的檢驗，與國標使用的培養基和檢驗過程比較，具有很大的優越性，可推廣應用于瓶（桶）裝水、水源水、城市二次供水等領域的銅綠假單胞菌的檢驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標準菌株

銅綠假單胞菌（ATCC 9027，ATCC 27853）、熒光假單胞菌（ATCC13525）、大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、糞鏈球菌（ATCC 29212）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、沙門氏菌（ATCC 14028）：美國菌種保藏中心。

1.1.2 儀器與試劑

密理博便攜式過濾系統；密理博過濾膜0.45 μm；海爾生物安全柜；三洋SANYO MLS-3050型高壓滅菌鍋；VDRTEX-5型旋渦混合儀；PL230型梅特勒電子天平；超凈工作臺。

CN假單胞菌選擇性培養基、乙酰胺液體培養基、金氏B培養基、API 20NE、銅綠假單胞菌顯色培養基等試劑，北京陸橋技術有限責任公司。

據《中國農民工調研報告》顯示，新生代農民工的受教育程度逐步提升，其受教育程度在農民工中的占比由20世紀80年代的小學教育水平為主，逐步過渡到90年代以初中教育水平為主，2000年后，這個群體中的高中生比重最大，到今天，新生代農民工多半接受了中專或大專教育，有的還接受了正規的大學教育。相比于老一代農民工，這些農民工在今天的信息時代，他們完全可以與城市同齡人一樣，借助于現代手段和信息技術完全可以獲取自己想要的不同知識，他們具有較強的信息獲取能力，其運用的途徑、手段和方式也多種多樣，網絡和自媒體成為其了解外部世界的常用手段，這些新生代農民工的知識獲取和知識更新速度和能力都與城市同齡人一樣。

1.2 方法

1.2.1 顯色培養基的特異性測試

將銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、大腸埃希氏菌、糞鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌在營養肉湯中過夜復蘇，挑取1環轉種于銅綠假單胞菌顯色平板，于36±1 ℃培養24 h，觀察各個菌株在顯色平板上的生長狀況，測試顯色平板的特異性。

1.2.2 顯色培養基的抑菌性測試

將大腸埃希氏菌、糞鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌在營養肉湯中過夜復蘇，分別制成104～105CFU菌懸液，涂布于顯色平板，于36±1 ℃培養24 h，觀察顯色平板上的雜菌生長狀況。

1.2.3 培養基靈敏度測試

將銅綠假單胞菌在營養肉湯中過夜復蘇，挑取1環至10 mL滅菌鹽水中，制成10-1CFU的菌懸液，然后對其進行十倍稀釋，制成10-2～10-7CFU的菌液。用微量移液器移取100 μL分別涂布于銅綠假單胞菌顯色培養基、CN假單胞菌選擇性培養基和營養瓊脂，置36℃生化培養箱中，24 h后對各個培養基上銅綠假單胞菌的數量計數。比較各個培養基的靈敏度。

1.2.4 過濾系統的使用

按要求將0.45 μ m密理博濾膜、250 mL無菌濾杯、濾器、真空泵等抽濾設備組合，對水樣進行過濾。

1.2.5 加標水樣測試

將銅綠假單胞菌在營養肉湯中過夜復蘇，挑取1環至10 mL滅菌鹽水中，制成10-1CFU的菌懸液，然后對其進行十倍稀釋，制成10-5～10-7的菌液。各取0.2 mL菌液加入250 mL水樣中，過濾檢測，將濾膜移置銅綠假單胞菌顯色培養基和CN假單胞菌選擇性培養基上，在36±1 ℃培養箱中培養24～48 h，觀察計數，比較兩種培養基的檢驗效果。

1.2.6 實際水樣的的檢驗

采集瓶（桶）裝水、水源水、環境水和城市二次供水，共計100份，對其進行銅綠假單胞菌檢驗。將250 mL水用0.45 μm密理博濾膜過濾，可根據污染情況適當稀釋，過濾檢驗，將濾膜移置銅綠假單胞菌顯色培養基和CN假單胞菌選擇性培養基上，在36±1 ℃培養箱中培養24～48 h，比較銅綠假單胞菌在這兩種培養基的檢出效果。

1.3 銅綠假單胞菌的鑒定

從濾膜上挑取1～5個可疑菌落，銅綠假單胞菌在顯色培養基上呈藍綠色、1～2 mm菌落，CN假單胞菌選擇性培養基上呈褐色或有熒光的菌落。轉種到營養瓊脂（NA）平板上純化培養，置36±1 ℃生化培養箱培養18～24 h。進行確證試驗 。

氧化酶試驗：取新配制的氧化酶試劑滴在干凈濾紙上，用玻璃棒將純化培養物涂布在濾紙上，顯深藍紫色的判為陽性反應。銅綠假單胞菌應為陽性反應。

金氏B試驗：將純化培養物轉種于金氏B培養基上，于36±1 ℃生化箱培養24～120 h。每天從培養箱中取出觀察是否產生熒光，將120 h內有熒光產生的記為陽性。

乙酰胺試驗：將純化培養物轉種于乙酰胺培養基中，在36±1 ℃下培養過夜，后向培養物滴加1～2滴鈉氏試劑，如出現磚紅色現象則為陽性，反之為陰性。

最終的鑒定采用API 20NE生化鑒定條。

2 結果與討論

2.1 銅綠假單胞菌顯色培養基的特異性測試結果

2.1.1 顯色培養基生長情況

如表1所示，銅綠假單胞菌在顯色平板上生長較好，有藍綠色菌落。熒光假單胞菌顯色平板上為白色菌落。其他菌不能良好生長或被抑制，表明顯色平板對銅綠假單胞菌有良好的特異性。

2.1.2 抑菌性測試

將大腸埃希氏菌、糞鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌在營養肉湯中過夜復蘇，分別制成104～105CFU菌懸液，涂布于顯色平板上都不能生長，證明顯色平板可以有效抑制104～105CFU數量的雜菌。

2.1.3 培養基靈敏度測試

統計30～300 CFU之間的菌落數，使用SPSS統計分析軟件進行方差分析，比較三種平板上菌落數。如表2所示，銅綠假單胞菌在三種培養基上的生長數量無顯著差異（p=0.901＞0.05），顯色平板能達到國標中使用的傳統培養基（CN假單胞菌選擇性培養基）的相同效果和靈敏度。

表1 各菌株在顯色平板上的生長狀況

表2 銅綠假單胞菌在三種平板的菌落數

2.2 加標水樣測試

統計濾膜上30～300 CFU之間的菌落數，使用SPSS統計分析軟件進行方差分析，比較兩種培養基在濾膜上菌落數。如表3所示，銅綠假單胞菌在這兩種平板濾膜上的生長數量無顯著差異（p=0.716 0＞0.05），銅綠假單胞菌顯色平板能達到國標中使用的傳統培養基（CN假單胞菌選擇性培養基）的相同效果和靈敏度。

表3 加標水樣在濾膜上菌落結果

2.3 實際水樣的的檢驗

如表4所示，試驗采集瓶（桶）裝水、水源水、環境水和城市二次供水，共計100份，其中桶裝水樣檢出3株銅綠假單胞菌，水源水檢出2株銅綠假單胞菌，環境水桶裝水檢出1株銅綠假單胞菌，其他水樣的結果均是未檢出。可疑水樣通過過濾檢驗，濾膜上出現銅綠假單胞菌可疑菌落，經純培養、初步鑒定、API 20NE鑒定試劑盒最終確認都是銅綠假單胞菌，兩種培養基的檢驗結果相同，表明銅綠假單胞菌顯色平板能達到國標中使用的傳統培養基（CN假單胞菌選擇性培養基）的相同效果。在實際檢驗中，銅綠假單胞菌顯色培養基可在24 h就能觀察結果，而CN假單胞菌選擇性培養基則需要培養到48 h方可觀察結果，在CN選擇性培養基上還出現4株假陽性的菌株，這些菌經鑒定均是熒光假單胞菌，在顯色培養基上為白色菌落，能夠和銅綠假單胞菌在顯色培養基上的藍綠色菌落特征區分開，從而降低假陽性率。但在實際水樣檢驗中未發現顯色培養基有假陽性現象。

表4 實際水樣檢出銅綠假單胞菌的結果

3 結論

銅綠假單胞菌是水質監測重要指標之一，此菌能使人患病，被國內外水質標準[5]列為重要的致病菌項目，并規定了銅綠假單胞菌的限量。傳統方法一般使用CN假單胞菌選擇性培養基經48 h培養后初步鑒定、純化、生化鑒定，檢驗周期太長，假陽性率很高。

因此，試驗采用銅綠假單胞菌顯色培養基經培養24 h可通過菌落的形態大小、顏色即可做出判斷，大大節省了勞動力和時間，且其靈敏度、特異性測試均與傳統培養基效果一致，樣品檢驗假陽性率較低，檢驗效果很好。

由于試驗采集的樣本數量、種類有一定的局限性，只是對銅綠假單胞菌顯色培養基的在水中檢驗初步應用做了一個介紹，還需要大量的實際樣本數據對實驗應用的支持和補充，但這一檢驗系統的建立對于銅綠假單胞菌的快速檢驗有重大意義，對國內水質檢驗標準的起草制定有一定的指導作用，可顯著提高水質檢驗水平，提高保障飲水和供水的安全