高效液相色譜-串聯質譜法測定水果中葉酸及其穩定性

葉曉利，康文懷，李巧玲，李慧，秦玲

河北科技大學生物科學與工程學院（石家莊 050018）

葉酸（Folic acid，FA或Folate）又稱維生素B9，是天然存在的葉酸的總稱，是人體正常發育和生長所必需的B族水溶性維生素，由喋啶（Pteridine）、對氨基苯甲酸（p-aminobenzoate）和帶有一個或多個谷氨酸鹽（Glutamate tail）三部分組成，葉酸分子結構及其衍生物如圖1所示。葉酸是人體內關鍵的輔助因子，在核酸、蛋白質、甲硫氨酸、絲氨酸等生物合成和代謝的單碳轉移反應中充當輔酶[1-2]，其缺乏可以增加許多疾病的風險，如誘發神經管缺陷、脊柱裂、無腦畸形[3]、心血管疾病、兒童白血病[4]、巨幼紅細胞性貧血[5]、老年人的神經認知衰退以及某些類型的癌癥等[6-7]，懷孕期間攝入葉酸可有效降低新生兒神經管缺陷的發生[8]。

圖1 葉酸分子結構及其衍生物

人體自身不能合成葉酸，必須從日常膳食中獲得[9]，因此有必要尋找富含葉酸的食物。天然葉酸來源有綠葉蔬菜、豆類、谷類、水果、堅果、肝臟等[10-12]。水果是一類容易得到、加工簡單或無需加工的日常食物，且富含水分和各種維生素，天然葉酸的含量相對較高。盡管許多食物含有豐富的天然葉酸，但葉酸不穩定，受溫度、紫外線、溶液pH、儲存時間、氧等因素影響[13-14]，因此需要對葉酸的穩定性進行分析。檢測葉酸的常用方法有微生物法[15]、熒光檢測法[16]、高效液相色譜法，微生物法能檢測葉酸及衍生物的總量，但高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯質譜法能測出單種葉酸的含量[17]，且快速、靈敏度高。試驗以常見的10種水果為原料，采用三酶法[18]提取水果中的葉酸（PteGlu）、四氫葉酸（H4PteGlu）、5-甲基-四氫葉酸（5-CH3-H4PteGlu），通過HPLCMS/MS進行測定，并選取不同的溫度、處理時間、pH進行穩定性研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水果（市售）；PteGlu、H4PteGlu、5-CH3-H4Pte-Glu、LC-MS級乙腈、甲酸（上海安譜實驗科技股份有限公司）；2-巰基乙醇（成都艾科達化學試劑有限公司）；抗壞血酸（天津市大茂化學試劑產）；二硫蘇糖醇（DTT）：麥克林化學試劑有限公司；蛋白酶（鏈絲菌蛋白酶E）、α-淀粉酶（美國Merck公司）；未過濾的大鼠血清、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、活性炭：中國國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

安捷倫1290高效液相色譜-安捷倫G6420三重串聯四級桿質譜儀（安捷倫科技有限公司）；TGL-16高速冷凍離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；MHY-22769旋渦振蕩器（北京美華儀科技有限公司）；ME104E電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；ZWY-100H/240恒溫培養振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配置

用50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7，含有1%的抗壞血酸和0.2% DTT[19]）制備0.1 mg/mL的3種葉酸標準溶液，作為儲備液，再用緩沖液配制PteGlu、H4PteGlu和5-CH3-H4PteGlu的系列質量濃度：10，20，40，60，80和100 ng/mL。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Aglient UPLC Poroshell C18柱（75 mm×2.1 mm×1.7 μ m）。流動相：A為0.1%甲酸-水溶液，B為0.1%甲酸-乙腈溶液。流速：0.2 mL/min。進樣量：1 μL。梯度洗脫程序：0～1 min（10% B），1～5 min（10%～80% B），5～10 min（80%～10% B），10～13 min（10% B）。柱溫：30 ℃。

1.3.3 質譜條件

電噴霧正離子模式，多反應檢測（MRM）模式；電噴霧電壓4 000 V，離子源溫度250 ℃，干燥氣溫度300 ℃，干燥氣流量10 L/min。

1.3.4 樣品的提取及含量的計算

取2.50 g水果于研缽中，加入5 mL 50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7，含有1%的抗壞血酸和0.2% DTT）進行研磨[20]，之后放入10 mL的試管并在旋渦振蕩器上混勻，將樣品煮沸10 min，冰上冷卻10 min，加入25 μL α-淀粉酶（20 mg/mL）混勻，放置10 min，加入200 μL蛋白酶（4 mg/mL）混勻，放恒溫培養振蕩器中（37 ℃，250 r/min，1 h），煮沸滅菌10 min，冰上快速冷卻20 min，加入100 μL經活性炭處理過的大鼠血清[21]，將樣品于恒溫培養振蕩器中（37 ℃，250 r/min，1 h），冰上冷卻20 min，離心（4 ℃，14 000 r/min，30 min）。取上清液，用超濾管（10 kDa Millipore）在離心機上過濾（4 ℃，12 000 r/min，30 min）[13]，取濾液分析。每個樣品重復3次，提取全過程在避光或弱光下進行。

提取溶液用HPLC-MS/MS進行檢測，得出的峰面積帶入標準曲線，得提取溶液中葉酸的溶度，并按式（1）計算葉酸的提取含量。

式中：m為葉酸的提取含量，μg/100 g；c為提取液的質量濃度，ng/mL；V為提取液的體積，mL；M為水果的質量，g。

1.3.5 葉酸的穩定性研究及葉酸回收率計算

分別用pH為6，7和8的磷酸鉀緩沖液（50 mmol/L，含有1%的抗壞血酸和0.2% DTT）制備1 μg/mL的PteGlu、H4PteGlu和5-CH3-H4PteGlu 3種標準溶液，3種pH不同的標準溶液在室溫（25 ℃）、37 ℃條件下分別放置4，8和12 h和在100 ℃條件下煮沸10，15和20 min，冷卻后進行測定。3種葉酸回收率計算為處理后檢測到的葉酸峰面積和未處理葉酸峰面積的百分比，如式（2）所示。

式中：s為處理后葉酸的峰面積；S為未處理葉酸的峰面積。

1.4 數據統計分析

所有試驗數據采用SPSS Statistics 17.0軟件進行方差分析（Analysis of variance，ANOVE），使用Origin 8軟件進行統計并繪圖。

2 結果與分析

2.1 色譜和質譜條件的優化

試驗對流動相（乙腈-水溶液、0.1%乙酸乙腈溶液-0.1%乙酸溶液、0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸溶液）進行了考察。結果表明，流動相采用加酸體系有助于化合物的離子化，使響應值增大，增加靈敏度；加入甲酸較乙酸分析時間短，峰形更好，如圖2所示。因此選用0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液作為流動相，以獲得更好的分離效果和儀器響應。

在電噴霧正離子（ESI+）模式下，對3種葉酸標準溶液進行稀釋和母離子全掃描，確定各分子離子峰；再以化合物的分子離子為母離子，對其子離子進行全掃描，選擇信噪比高、峰形好、干擾小的離子對作為定量、定性離子對，對子離子的破碎電壓、碰撞能量等參數進行優化，結果見表1。

2.2 工作曲線、定量檢出限和回收率

試驗以3種葉酸濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制PteGlu、H4PteGlu、5-CH3-H4PteGlu的工作曲線，質量濃度為10～100 ng/mL，得到線性回歸方程及相關系數，3種葉酸均有較好的線性關系。以信噪比（S/N）為3確定檢出限（LOD），以信噪比（S/N）為10確定定量限（LOQ）。取橙子和獼猴桃，加入3種葉酸標品，質量濃度為40，60和80 ng/mL，按照1.3.4小節進行操作，每個添加濃度平行3次，計算平均回收率，結果如表2所示。檢出限、定量限和回收率

2.3 常見水果中3種葉酸的提取含量

表3表示10種常見水果中PteGlu、H4PteGlu、5-CH3-H4PteGlu的含量。不同的水果PteGlu含量差異較大，含量范圍在3.11～27.33 μg/100 g之間，其中獼猴桃、芒果、香蕉PteGlu含量相對較多，含量在20 μg/100 g以上，而橙子、檸檬、火龍果、葡萄PteGlu含量相對較少，含量在6 μg/100 g以下。水果中H4PteGlu的含量，獼猴桃中H4PteGlu的含量明顯多于其他水果，含量約為26.87 μ g/100 g，剩余水果含量在10.65～12.46 μ g/100之間。葡萄中5-CH3-H4PteGlu的含量明顯高于PteGlu、H4PteGlu，含量達到32.72 μg/100 g。獼猴桃中3種葉酸的總含量最高，達到63.09 μg/100 g，檸檬的含量最低，含量為27.47 μ g/100 g。

2.4 葉酸的穩定性

2.4.1 不同的溫度、時間、pH對PteGlu穩定性的影響

圖3表示不同的溫度（A室溫、B 37 ℃、C 100℃）、時間、pH對PteGlu穩定性的影響。由圖3（A）可以看出，在室溫條件下，隨著時間的延長，PteGlu的保留率略有減少，不同pH對PteGlu的穩定性有影響，在pH 7和8較pH 6穩定。由圖3（B）可以看出，在37 ℃條件下，時間對PteGlu穩定性的影響不大，PteGlu在pH 7較pH 6和8條件下穩定。由圖3（C）可以看出，在100 ℃條件下，PteGlu在pH 7和8條件下保留率在87%以上，在pH 6時穩定性明顯下降，保留率在65%左右，這可能是PteGlu在酸性高溫條件下轉化為葉酸的其他衍生物[22]。

圖3 不同的溫度、時間、pH對PteGlu穩定性的影響

2.4.2 不同的溫度、時間、pH對H4PteGlu穩定性的影響

圖4 不同的溫度、時間、pH對H4PteGlu穩定性的影響

圖4 表示不同的溫度（A室溫、B 37 ℃、C 100℃）、處理時間、pH對H4PteGlu穩定性的影響。由圖4（A和B）可以看出，在室溫和37 ℃條件下，時間對H4PteGlu的穩定性影響較小，但pH對H4PteGlu的穩定性較大，pH在6時，H4PteGlu的保留率在90%以上。在100 ℃條件下，隨著煮沸時間的延長，H4PteGlu保留率逐漸降低，且在pH 6較pH 7和8穩定。H4PteGlu不穩定可能是H4PteGlu在中性或弱堿性條件下轉化成5，10-CH2-H4PteGlu或H2PteGlu[13]。

2.4.3 不同的溫度、時間、pH對5-CH3-H4PteGlu穩定性的影響

圖5表示不同的溫度（A室溫、B 37 ℃、C 100℃）、時間、pH對5-CH3-H4PteGlu穩定性的影響。在pH 6的條件下，5-CH3-H4PteGlu在不同溫度和時間下都很穩定，保留率在95%以上，但不同的pH對5-CH3-H4PteGlu穩定性的影響較大，這可能是5-CH3-H4PteGlu在中性和偏堿性條件下轉換為5-CH3-5，6-H2PteGlu，使其保留率下降[23]。

圖5 不同的溫度、時間、pH對5-CH3-H4PteGlu穩定性的影響

3 結論

試驗建立了HPLC-MS/MS測定水果中葉酸、四氫葉酸、5-甲基-四氫葉酸的方法。該方法靈敏度高、檢出限低，5-甲基-四氫葉酸的檢出限為1 ng/mL，葉酸、四氫葉酸的檢出限均為2 ng/mL，相關系數R2均大于0.99，平均回收率在59.34%～65.67%之間。研究發現，10種水果中3種葉酸的含量差異較大，葉酸的含量范圍在3.11～27.33 μ g/100 g之間，四氫葉酸的含量范圍在10.65～26.87 μg/100 g之間，5-甲基-四氫葉酸的含量范圍在8.33～32.72 μg/100 g之間，3種葉酸的總含量的大小為獼猴桃＞香蕉＞芒果＞葡萄＞梨＞橙子＞蘋果＞桔子＞火龍果＞檸檬。pH對3種葉酸穩定性的影響較大，溫度和時間影響相對較小，葉酸在pH 7較穩定，四氫葉酸和5-甲基-四氫葉酸在pH 6較穩定。該研究為人們合理攝入葉酸提供參考依據，也為葉酸及衍生物的分析提供技術支持。