固相萃取-高效液相色譜法測定鹵菜中的蒂巴因

陳偉，喬勇升，胡慧

泰州市食品藥品檢驗所（泰州 225300）

蒂巴因是罌粟植物中的一種生物堿，有一定的藥用價值，也是一些藥物合成中的重要中間體，其中罌粟殼中就含有的這類生物堿[1]。蒂巴因不僅會導致人失眠或者嗜睡，引起心理上某種程度的愜意和愉悅感，還會導致人注意力、記憶和思維各方面身體性能的衰退，如果長期食用還會引起精神紊亂，神經失常，使神經和消化系統受到損害，造成內分泌失調最終成癮，嚴重時甚至會致人窒息和死亡[2-4]。我國對于罌粟殼的使用有明確的法律規定，嚴禁非法使用。有的不法商販利用罌粟殼能使人成癮，在食品中尤其是鹵菜、火鍋等食物的湯輔料中進行罌粟殼及其水浸物的非法添加，使消費者成癮，以此來吸引更多的顧客，從中牟取暴利，極大地危害人民群眾的身體健康。因此，能快速、準確、高效地檢測出鹵菜類食品中是否非法添加罌粟殼，是否含蒂巴因等生物堿含量，可以為執法機構提供有力的技術支持，具有很大的社會價值。

目前，蒂巴因的檢測研究方法并不多，參照相關文獻[5-9]中罌粟堿類物質的檢測研究方法，并結合蒂巴因物質本事的特點，選擇液相色譜法檢測，并結合熒光檢測器對含苯環類物質特有的熒光反應，應用于鹵菜類食品中蒂巴因的檢測，并優化檢測參數，開發一種簡單、快捷的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜系統（Waters 2695）；二極管陣列檢測器（Waters 2625）；熒光檢測器（Waters 2475）。

蒂巴因溶液標準物質（100 μg/mL，lot 228012，購于中國計量科學研究院）；甲醇、乙腈（色譜純）；HLB固相萃取柱（Waters公司）。

1.2 色譜條件

色譜柱Waters RP C18（4.6 mm×250 mm，5 μ m）；流速1.0 mL/min；進樣量20 μL；柱溫30 ℃；熒光檢測器，發射波長477 nm，激發波長333 nm；二極管陣列檢測器，檢測波長284 nm。

1.3 試驗方法

1.3.1 檢測器的選擇對蒂巴因色譜行為的影響

蒂巴因的檢測一般都可以用二極管陣列檢測器和熒光檢測器這兩種檢測器來檢測，試驗對兩種檢測器分析比較，選擇較合適檢測蒂巴因的檢測器。

1.3.2 不同流動相體系對蒂巴因色譜行為的影響

參考文獻[10-12]，蒂巴因屬于極性化合物，因此流動相以水和乙腈作為基礎溶劑。為了促進樣品的離子化，試驗比較了流動相中加入三乙胺對蒂巴因分離效果的影響。分別考察不同濃度的三乙胺水溶液以及不同的流動相比例對蒂巴因目標峰分離度以及色譜基線的影響，確定最佳流動相體系。

1.3.3 標準曲線的制作

吸取相應體積的蒂巴因標準溶液（100 μ g/mL），用乙腈分別配制成0.5，1.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μg/mL一系列標準溶液，進液相色譜儀進行分析，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.4 提取溶劑的選擇、凈化方式的比較

參考文獻[13-16]，一般選用固液提取法進行提取，并選擇HLB小柱進行凈化富集。結合鹵菜類食品的樣品性質，選擇體積分數20%乙腈溶液進行蒂巴因的提取，并分別比較不同料液比、洗脫液對目標物測定值的影響。

1.3.5 樣品的加標回收試驗

以未檢出蒂巴因的鹵菜為空白基質，加入蒂巴因標準溶液，使用固相萃取提取后，上機檢測計算回收率。

2 結果與分析

2.1 檢測器的選擇對蒂巴因色譜行為的影響

如圖1所示，二極管陣列檢測器和熒光檢測器均采用外標法定量，且目標物在兩種檢測器中都有響應。但是相比較二極管陣列檢測器，熒光檢測器的靈敏度更高，基質干擾更小，一般情況下熒光檢測器比二極管陣列檢測器的靈敏度高約兩個數量級，同樣濃度的蒂巴因溶液，在熒光檢測器中得到的目標峰響應值更高，穩定性更好，所以試驗選擇熒光檢測器進行檢測。

2.2 流動相體系對蒂巴因色譜行為的影響

流動相中加入0.01%三乙胺后，流動相體系有較好的穩定性，能抑制蒂巴因色譜峰的拖尾現象，故確定采用乙腈-三乙胺體系。再比較三乙胺水溶液濃度對目標物色譜行為的影響，分別以0.02%，0.01%和0.005%三乙胺水溶液為流動相，結果顯示，以0.005%三乙胺水溶液進行洗脫時，色譜峰基線發生漂移，以0.02%和0.01%三乙胺水溶液進行洗脫時色譜峰都較好，為了保護色譜柱，故選擇乙腈-0.01%三乙胺水溶液為流動相。對流動相比例進行了優化考察，結果發現乙腈-0.01%三乙胺水溶液（70∶30，V/V）等度洗脫時，色譜峰基線穩，峰形好，分離度均大于1.5，不對稱因子在0.95～1.05之間。

2.3 標準曲線、檢出限和定量限

為了驗證蒂巴因在乙腈-0.01%三乙胺水溶液（70∶30，V/V）流動相體系中的線性關系，配制了蒂巴因質量濃度分別為0.5，1.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μg/mL的系列標準溶液。結果表明，蒂巴因在0.5～50.0 μg/mL內均具有良好的線性關系（r2＞0.99），具體見表1。

圖1 二極管陣列檢測器（a）和熒光檢測器（b）對蒂巴因色譜圖的影響

表1 蒂巴因的保留時間、標準曲線、相關系數、檢出限與定量限

2.4 前處理條件的優化

2.4.1 提取溶劑的選擇

稱取2.0 g樣品與20%乙腈提取液，分別按料液比1∶2，1∶5，1∶10，1∶15和1∶20（g/mL）混合，超聲提取30 min后，在上述優化好的儀器條件下測定，以加標回收率為比較依據。

如圖2所示，當料液比為1∶5和1∶10（g/mL）時，蒂巴因的測定回收率明顯高于1∶2，1∶15和1∶20（g/mL）時的含量。溶劑過少，兩相濃度梯度小，蒂巴因不能被完全溶出。隨著料液比的增大，兩相濃度梯度增大，蒂巴因逐漸被溶出，回收率不斷增加；當料液比為1∶5（g/mL）時，蒂巴因的測定值最高，且誤差線較小。當料液比達到1∶10（g/mL）時，進一步增加溶劑的量，可能會溶解更多樣品中的其他的物質，妨礙蒂巴因的提取分離，導致蒂巴因的含量下降。而溶劑過多導致提取液濃度較低，不利于后續HPLC檢測，增大測定結果的誤差，同時也會造成資源浪費，所以料液比選用1∶5（g/mL）。

2.4.2 洗脫液的選擇

試驗選用HLB固相萃取小柱對蒂巴因進行凈化和富集。在對小柱的洗脫液方面，分別比較了超純水及體積分數25%，50%，75%和100%甲醇溶液的洗脫效果，結果以回收率為比較依據。

如圖3所示，當甲醇體積分數為25%時，蒂巴因的回收率較高，此時25%甲醇的溶液洗脫能力較強，能較完全地洗脫目標物，所以試驗選擇體積分數為25%的甲醇溶液作為樣品的洗脫液。

圖2 不同比例提取液對蒂巴因的回收率的影響

圖3 洗脫液對蒂巴因回收率的影響

2.4.3 洗脫液體積的選擇

在上述選用25%甲醇作為HLB固相萃取小柱洗脫液的基礎上，比較了洗脫液體積對蒂巴因回收率的影響。分別比較了超純水1，2，3，4和5 mL 5種體積對蒂巴因目標物洗脫效果的影響。

如圖4所示，隨著洗脫液體積不斷增加，蒂巴因的回收率逐漸升高，但洗脫液體積達到3 mL以后再增加洗脫劑體積，蒂巴因回收率并沒有明顯增加，此時HLB固相萃取小柱中的目標物較完全地被洗脫出，再增加洗脫液體積對蒂巴因的回收率影響不大，所以選擇3 mL為洗脫體積較合適。

圖4 洗脫液體積對蒂巴因回收率的影響

2.5 加標回收與陽性樣品

分別添加1.0，10.0和50.0 μg/kg共3個梯度濃度的蒂巴因標準溶液，進行加標回收試驗，每個濃度重復測定5次，結果見表2。蒂巴因的加標回收率范圍為91.5%～94.2%，相對標準偏差（RSD）為3.1%～6.8%，表明試驗所建立的檢測蒂巴因的方法具有可靠的準確度和精密度。圖5為陽性樣品的色譜圖。

表2 方法的回收率及相對標準偏差（n=5） %

圖5 陽性樣品的色譜圖

3 結論

試驗建立了一種固相萃取-高效液相色譜法檢測食品中蒂巴因的分析方法。該方法的準確度和精密度是可行的，前處理選擇用的固相萃取可以縮短前處理時間，節約成本。試驗結果表明，在乙腈-0.01%三乙胺水溶液（70∶30，V/V）體系中，蒂巴因得到了良好的基線分離。樣品在經20%乙腈提取后，采用HLB固相萃取柱法以3 mL 25%甲醇作為洗脫溶劑，可有效去除樣品中的復雜基質對目標峰的影響，實現對蒂巴因的凈化與富集。樣品的加標回收率在91.5%～94.2%之間，符合檢測要求。