固相萃取-高效液相色譜法測定鹵菜中的蒂巴因

陳偉，喬勇升，胡慧

泰州市食品藥品檢驗所（泰州 225300）

蒂巴因是罌粟植物中的一種生物堿，有一定的藥用價值，也是一些藥物合成中的重要中間體，其中罌粟殼中就含有的這類生物堿[1]。蒂巴因不僅會導(dǎo)致人失眠或者嗜睡，引起心理上某種程度的愜意和愉悅感，還會導(dǎo)致人注意力、記憶和思維各方面身體性能的衰退，如果長期食用還會引起精神紊亂，神經(jīng)失常，使神經(jīng)和消化系統(tǒng)受到損害，造成內(nèi)分泌失調(diào)最終成癮，嚴(yán)重時甚至?xí)氯酥舷⒑退劳鯷2-4]。我國對于罌粟殼的使用有明確的法律規(guī)定，嚴(yán)禁非法使用。有的不法商販利用罌粟殼能使人成癮，在食品中尤其是鹵菜、火鍋等食物的湯輔料中進(jìn)行罌粟殼及其水浸物的非法添加，使消費者成癮，以此來吸引更多的顧客，從中牟取暴利，極大地危害人民群眾的身體健康。因此，能快速、準(zhǔn)確、高效地檢測出鹵菜類食品中是否非法添加罌粟殼，是否含蒂巴因等生物堿含量，可以為執(zhí)法機(jī)構(gòu)提供有力的技術(shù)支持，具有很大的社會價值。

目前，蒂巴因的檢測研究方法并不多，參照相關(guān)文獻(xiàn)[5-9]中罌粟堿類物質(zhì)的檢測研究方法，并結(jié)合蒂巴因物質(zhì)本事的特點，選擇液相色譜法檢測，并結(jié)合熒光檢測器對含苯環(huán)類物質(zhì)特有的熒光反應(yīng)，應(yīng)用于鹵菜類食品中蒂巴因的檢測，并優(yōu)化檢測參數(shù)，開發(fā)一種簡單、快捷的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜系統(tǒng)（Waters 2695）；二極管陣列檢測器（Waters 2625）；熒光檢測器（Waters 2475）。

蒂巴因溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 μg/mL，lot 228012，購于中國計量科學(xué)研究院）；甲醇、乙腈（色譜純）；HLB固相萃取柱（Waters公司）。

1.2 色譜條件

色譜柱Waters RP C18（4.6 mm×250 mm，5 μ m）；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫30 ℃；熒光檢測器，發(fā)射波長477 nm，激發(fā)波長333 nm；二極管陣列檢測器，檢測波長284 nm。

1.3 試驗方法

1.3.1 檢測器的選擇對蒂巴因色譜行為的影響

蒂巴因的檢測一般都可以用二極管陣列檢測器和熒光檢測器這兩種檢測器來檢測，試驗對兩種檢測器分析比較，選擇較合適檢測蒂巴因的檢測器。

1.3.2 不同流動相體系對蒂巴因色譜行為的影響

參考文獻(xiàn)[10-12]，蒂巴因?qū)儆跇O性化合物，因此流動相以水和乙腈作為基礎(chǔ)溶劑。為了促進(jìn)樣品的離子化，試驗比較了流動相中加入三乙胺對蒂巴因分離效果的影響。分別考察不同濃度的三乙胺水溶液以及不同的流動相比例對蒂巴因目標(biāo)峰分離度以及色譜基線的影響，確定最佳流動相體系。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

吸取相應(yīng)體積的蒂巴因標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μ g/mL），用乙腈分別配制成0.5，1.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μg/mL一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)液相色譜儀進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 提取溶劑的選擇、凈化方式的比較

參考文獻(xiàn)[13-16]，一般選用固液提取法進(jìn)行提取，并選擇HLB小柱進(jìn)行凈化富集。結(jié)合鹵菜類食品的樣品性質(zhì)，選擇體積分?jǐn)?shù)20%乙腈溶液進(jìn)行蒂巴因的提取，并分別比較不同料液比、洗脫液對目標(biāo)物測定值的影響。

1.3.5 樣品的加標(biāo)回收試驗

以未檢出蒂巴因的鹵菜為空白基質(zhì)，加入蒂巴因標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用固相萃取提取后，上機(jī)檢測計算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測器的選擇對蒂巴因色譜行為的影響

如圖1所示，二極管陣列檢測器和熒光檢測器均采用外標(biāo)法定量，且目標(biāo)物在兩種檢測器中都有響應(yīng)。但是相比較二極管陣列檢測器，熒光檢測器的靈敏度更高，基質(zhì)干擾更小，一般情況下熒光檢測器比二極管陣列檢測器的靈敏度高約兩個數(shù)量級，同樣濃度的蒂巴因溶液，在熒光檢測器中得到的目標(biāo)峰響應(yīng)值更高，穩(wěn)定性更好，所以試驗選擇熒光檢測器進(jìn)行檢測。

2.2 流動相體系對蒂巴因色譜行為的影響

流動相中加入0.01%三乙胺后，流動相體系有較好的穩(wěn)定性，能抑制蒂巴因色譜峰的拖尾現(xiàn)象，故確定采用乙腈-三乙胺體系。再比較三乙胺水溶液濃度對目標(biāo)物色譜行為的影響，分別以0.02%，0.01%和0.005%三乙胺水溶液為流動相，結(jié)果顯示，以0.005%三乙胺水溶液進(jìn)行洗脫時，色譜峰基線發(fā)生漂移，以0.02%和0.01%三乙胺水溶液進(jìn)行洗脫時色譜峰都較好，為了保護(hù)色譜柱，故選擇乙腈-0.01%三乙胺水溶液為流動相。對流動相比例進(jìn)行了優(yōu)化考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.01%三乙胺水溶液（70∶30，V/V）等度洗脫時，色譜峰基線穩(wěn)，峰形好，分離度均大于1.5，不對稱因子在0.95～1.05之間。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

為了驗證蒂巴因在乙腈-0.01%三乙胺水溶液（70∶30，V/V）流動相體系中的線性關(guān)系，配制了蒂巴因質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。結(jié)果表明，蒂巴因在0.5～50.0 μg/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（r2＞0.99），具體見表1。

圖1 二極管陣列檢測器（a）和熒光檢測器（b）對蒂巴因色譜圖的影響

表1 蒂巴因的保留時間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

2.4 前處理條件的優(yōu)化

2.4.1 提取溶劑的選擇

稱取2.0 g樣品與20%乙腈提取液，分別按料液比1∶2，1∶5，1∶10，1∶15和1∶20（g/mL）混合，超聲提取30 min后，在上述優(yōu)化好的儀器條件下測定，以加標(biāo)回收率為比較依據(jù)。

如圖2所示，當(dāng)料液比為1∶5和1∶10（g/mL）時，蒂巴因的測定回收率明顯高于1∶2，1∶15和1∶20（g/mL）時的含量。溶劑過少，兩相濃度梯度小，蒂巴因不能被完全溶出。隨著料液比的增大，兩相濃度梯度增大，蒂巴因逐漸被溶出，回收率不斷增加；當(dāng)料液比為1∶5（g/mL）時，蒂巴因的測定值最高，且誤差線較小。當(dāng)料液比達(dá)到1∶10（g/mL）時，進(jìn)一步增加溶劑的量，可能會溶解更多樣品中的其他的物質(zhì)，妨礙蒂巴因的提取分離，導(dǎo)致蒂巴因的含量下降。而溶劑過多導(dǎo)致提取液濃度較低，不利于后續(xù)HPLC檢測，增大測定結(jié)果的誤差，同時也會造成資源浪費，所以料液比選用1∶5（g/mL）。

2.4.2 洗脫液的選擇

試驗選用HLB固相萃取小柱對蒂巴因進(jìn)行凈化和富集。在對小柱的洗脫液方面，分別比較了超純水及體積分?jǐn)?shù)25%，50%，75%和100%甲醇溶液的洗脫效果，結(jié)果以回收率為比較依據(jù)。

如圖3所示，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為25%時，蒂巴因的回收率較高，此時25%甲醇的溶液洗脫能力較強(qiáng)，能較完全地洗脫目標(biāo)物，所以試驗選擇體積分?jǐn)?shù)為25%的甲醇溶液作為樣品的洗脫液。

圖2 不同比例提取液對蒂巴因的回收率的影響

圖3 洗脫液對蒂巴因回收率的影響

2.4.3 洗脫液體積的選擇

在上述選用25%甲醇作為HLB固相萃取小柱洗脫液的基礎(chǔ)上，比較了洗脫液體積對蒂巴因回收率的影響。分別比較了超純水1，2，3，4和5 mL 5種體積對蒂巴因目標(biāo)物洗脫效果的影響。

如圖4所示，隨著洗脫液體積不斷增加，蒂巴因的回收率逐漸升高，但洗脫液體積達(dá)到3 mL以后再增加洗脫劑體積，蒂巴因回收率并沒有明顯增加，此時HLB固相萃取小柱中的目標(biāo)物較完全地被洗脫出，再增加洗脫液體積對蒂巴因的回收率影響不大，所以選擇3 mL為洗脫體積較合適。

圖4 洗脫液體積對蒂巴因回收率的影響

2.5 加標(biāo)回收與陽性樣品

分別添加1.0，10.0和50.0 μg/kg共3個梯度濃度的蒂巴因標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，每個濃度重復(fù)測定5次，結(jié)果見表2。蒂巴因的加標(biāo)回收率范圍為91.5%～94.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.1%～6.8%，表明試驗所建立的檢測蒂巴因的方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度。圖5為陽性樣品的色譜圖。

表2 方法的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5） %

圖5 陽性樣品的色譜圖

3 結(jié)論

試驗建立了一種固相萃取-高效液相色譜法檢測食品中蒂巴因的分析方法。該方法的準(zhǔn)確度和精密度是可行的，前處理選擇用的固相萃取可以縮短前處理時間，節(jié)約成本。試驗結(jié)果表明，在乙腈-0.01%三乙胺水溶液（70∶30，V/V）體系中，蒂巴因得到了良好的基線分離。樣品在經(jīng)20%乙腈提取后，采用HLB固相萃取柱法以3 mL 25%甲醇作為洗脫溶劑，可有效去除樣品中的復(fù)雜基質(zhì)對目標(biāo)峰的影響，實現(xiàn)對蒂巴因的凈化與富集。樣品的加標(biāo)回收率在91.5%～94.2%之間，符合檢測要求。