絨毛蛋白1在單側腎切除Habu腎炎小鼠模型中的作用

蔣紅利, 馬紅葉, 薛瑾虹, 孫凌霜, 陳 蕾

(西安交通大學第一附屬醫院血液凈化科, 西安 710061)

系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MesGN)是中國最常見的腎小球腎炎類型，也是引發終末期腎病的主要病因。MesGN以系膜細胞增殖伴系膜基質擴張為特征，其發生機制被認為與細胞增殖、凋亡和免疫失衡有關。竹葉青蛇毒(Habu snake venom，HSV)誘導的小鼠Habu腎小球腎炎是與人MesGN腎小球病變相似的經典實驗動物模型[1-3]。研究[4]顯示，單次注射HSV誘導的腎小球改變可在1個月后自愈，然而, 單側腎切除術(unilateral nephrectomy，UNX)后再行注射抗HSV，將導致更嚴重的腎損傷和不可逆的腎小球硬化。上述現象表明，UNX可加劇Habu腎炎模型腎功能不全表現，但其機制尚不清楚。

絨毛蛋白1(villin-1, VIL1)是一種細胞骨架蛋白, 廣泛存在于哺乳動物中, 具有調節微絨毛肌動蛋白絲重組的作用，參與肌動蛋白成核、肌動蛋白絲束組裝、肌動蛋白絲封蓋和切斷等過程[5], 故而在調節細胞形態、細胞侵襲、細胞遷移和細胞凋亡中發揮重要作用。在腎臟疾病中，VIL1與急性腎損傷密切相關，可作為急性腎小管損傷的新型生物標志物，但其在腎小球腎炎系膜細胞受損過程中的作用及機制尚不清楚。

本研究分別于正常C57BL/6小鼠和UNX的C57BL/6小鼠中建立了HSV誘導的Habu腎炎模型，比較二者在腎功能、細胞增殖及凋亡水平的異同，并采用蛋白質組學方法篩選出在二者中差異表達的VIL1蛋白，探索VIL1在UNX后腎小球腎炎中的作用和相關機制，為進一步闡明此類疾病的發病機制提供新的視角。

1 材料與方法

1.1 動物和細胞

SPF級6周齡雄性C57BL/6小鼠24只，體質量18～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0011])，并飼養于西安交通大學醫學院實驗動物中心[SYXK(陜)2015-002],溫度24℃，濕度40%～70%，12 h光照12 h黑暗交替，自由攝取食物和水。動物福利和實驗程序嚴格按照《實驗室動物護理和使用指南》(美國國家研究委員會，1996年)執行。

小鼠系膜細胞(MMCs)系SV40 MES 13細胞(ATCC?CRL-1927TM)購自美國ATCC公司。

1.2 主要試劑

HSV購自日本Wako Pure Chemical Industries公司，5%胎牛血清(貨號：26140)、ClickiT?EdU Alexa Fluor?555成像試劑盒(貨號：C10638)、Hoechst 33342試劑(貨號：3570)和Thermo BCA試劑盒(貨號：23235)購自美國Invitrogen公司，RPMI 1640培養基(貨號: 10-040-CVR-500 mL)購自美國康寧公司，VIL1抗體(貨號：16488-1-AP)購自美國Proteintech公司，caspase 3抗體(貨號：ab90437)及p21抗體(貨號：ab86696)購自英國Abcam公司，Bax抗體(貨號：2772S)及 p27 抗體(貨號: 2552S)購自美國Cell Signaling Technology公司，β-actin抗體(貨號: SAB1305546)購自美國Sigma-Aldrich公司; 辣根過氧化物酶標記山羊抗兔抗體(貨號：A0208)、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠抗體(貨號：A0216)購自武漢碧云天生物技術公司; siRNA序列由上海吉瑪公司設計合成。

1.3 主要儀器

液相串聯質譜分析儀(XEVO QTOF)購自英國Waters 公司；正置光學顯微鏡(BX43)購自日本奧林巴斯公司，熒光倒置顯微鏡(TI-E)購自日本尼康公司；UVP凝膠成像系統(EC3-410)購于美國UVP公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 HSV腎炎模型的建立 將24只小鼠隨機分為2組。實驗組(n=12)接受UNX：質量分數1%戊巴比妥鈉溶液(80 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉滿意后常規備皮、消毒、鋪無菌巾，小鼠左側臥位, 行背部右側切口, 位置為脊柱右旁開0.5 cm,肋弓下緣起始，長約1 cm豎行切口，暴露右腎，鈍性分離腎蒂，1號線結扎腎蒂，從結扎處遠端離斷腎血管及輸尿管, 摘除右腎, 逐層縫合肌層、皮膚。對照組(n=12)僅接受假手術(即背部右側縱行切口切開縫合術, 不行右腎摘除)。一周后, 上述2組小鼠通過尾靜脈注射HSV (2.5 mg/kg)誘導Habu模型(分別標記為HSV組及HSV-UNX組)。2組小鼠均于HSV注射后7 d以 1%戊巴比妥鈉溶液(80 mg/kg)腹腔注射麻醉，采用心臟取血法采集血液標本用于生化檢測；行腹正中切口，取小鼠腎皮質組織，其中一半固定于體積分數10%甲醛溶液中，用于病理學和免疫組織化學檢測；另一半腎皮質組織采用篩網技術分離腎小球并置于液氮保存, 用于后續蛋白組學和Western blotting檢測; 取材結束后, 以頸椎脫臼法對小鼠實施安死術。

1.4.2 過碘酸-雪夫染色(PAS染色)觀察小鼠腎組織病理改變 將固定于體積分數10%甲醛溶液的腎臟組織常規脫水、石蠟包埋、制片。切片常規脫蠟后，放入1%過碘酸浸泡15 min，Schiff液浸泡20 min，蘇木素浸泡3 min染細胞核；1%鹽酸乙醇分化數秒，水洗后氨水返藍，流水充分沖洗；85%、95%、100%乙醇梯度脫水、二甲苯透明，樹脂封固；于光學顯微鏡(×400)下觀察腎組織病理改變。

1.4.3 腎組織蛋白組學檢測 從HSV組及HSVUNX組分別取6只小鼠的腎組織用于蛋白組學檢測。首先, 對腎小球蛋白行二維凝膠電泳分析: 用裂解緩沖液分離腎小球蛋白，采用50 mmol/L NaOH將蛋白pH值調整為8.5，用裂解液將質量濃度調整為5 mg/mL。將2組樣品中等量的蛋白質匯集在一起作為內參。每個樣品取50 μg蛋白質置于冰上, 采用400 pmol Cy3、Cy5分別標記HSV組及HSV-UNX組蛋白, 用400 pmol Cy2標記內參, 共30 min, 后加入1 μL賴氨酸(10 mmol/L)淬滅。將50 μg 已標記Cy3及Cy5的蛋白混合后，再與50 μg標記Cy2的蛋白混合，再加入2倍體積的緩沖液, 將加入緩沖液后的樣本置于23 cm、pH3, 11 (NL) IPG上, 采用IPGphor IEF系統進行等電聚焦。等電聚焦設置為: 30 V共12 h, Grd 200 V共6 h，Grd 500 V共3 h，Grd 10000 V共1 h，64 000 V 共1h。將IPG條帶置于12%均質聚丙烯酰胺凝膠的頂部，將0.9%瓊脂糖包覆于含溴酚藍流動緩沖液中，置于15 ℃的Ettan DALT 6電泳系統中電泳過夜。電泳結束后，用Typhoon 9400成像儀掃描二維凝膠。根據說明書, 使用DeCyder 6.0軟件(GE Healthcare)對二維凝膠上的蛋白斑點進行分析, 確定2組間存在顯著變化的斑點。其次, 對2組間存在顯著變化的斑點進行蛋白鑒定: 對具有顯著變化蛋白斑點切膠回收并脫色后, 置于10 mmol/L二硫蘇糖醇中56 ℃孵育1 h，在55 mmol /L IAM中室溫避光45 min。采用離心凍干法凍干凝膠，并用0.05 mg/mL胰蛋白酶過夜消化, 以2%三氟乙酸停止反應。采用二維液相串聯質譜分析儀對多肽進行分析。在第一維度使用溶劑A(200 mmol甲酸銨, pH值10.0)和溶劑B (CH3CN)，采用Masslynx 4.1自動設置的3個溶劑塞，依次洗脫餾分。在第二個維度,使用nanoACQUITY系統進行肽篩選。程序和數據步驟與先前研究[6]相似。對于得到的數據使用自歸一化函數進行歸一化，使用NCBI數據庫(2012年3月發布)作為參考數據庫, 僅保留高置信度蛋白(OK=2)作進一步分析。采用PLGS 2.4進行統計分析, 差異表達蛋白(differentially expressed proteins, DEPs)定義為: P＜0.05且Fold Change＞1.5。

1.2.4 MMCs培養及siRNA轉染 MMCs 置于含5%胎牛血清(購自美國Invitrogen公司)的RPMI 1640培養基中, 在37 ℃，5% CO2恒溫細胞孵育箱中培養。穩定培養MMCs，待細胞匯合度超過70%時, 使用0.25% 胰酶消化, 常溫1 300 r/min離心5min，棄上清，加入新鮮培養基重懸細胞，細胞計數; 以每孔4×105細胞數接種入6孔板中;將6 μL siRNA(si-VIL1或NC)加入250 μL Opptimedium(每孔), 充分混勻后室溫靜置5 min，再加入6 μL RNAi Max (每孔)，振蕩混勻，室溫靜置15 min后將含siRNA的轉染混合液垂直緩慢滴入六孔板中，37 ℃孵育24 h后，更換新鮮培養液，再培養48h收集細胞，待后續檢測。

1.2.5 Hoechst染色檢測細胞凋亡 將潔凈蓋玻片置于體積分數70%乙醇溶液中浸泡10 min，取出后放于無菌超凈臺內吹干, 用細胞培養液洗滌3次后，將蓋玻片置于6孔板內，接種MMCs后培養并按照1.2.4中的步驟轉染siRNA。轉染48 h后,吸盡培養液，加入0.5 mL固定液固定10 min。吸取固定液后每孔加入2 mL PBS，置于搖床上漂洗3 min，共漂洗2次。吸盡PBS后，加入10 μg/mL Hoechst 33342試劑，于37 ℃避光孵育10 min。孵育結束后, 用PBS洗2次，每次3 min。加一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片。在200倍熒光顯微鏡下，每孔隨機選取5個視野，觀察細胞核濃縮細胞。通過計算細胞核濃縮細胞占細胞總數的百分比，明確細胞凋亡的程度。

1.2.6 5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷(EdU)染色檢測細胞增殖 使用ClickiT?EdU Alexa Fluor?555成像試劑盒對轉染48 h的MMCs進行EdU檢測，所有步驟嚴格遵循說明書進行。染色后，EdU陽性細胞的細胞核為紅色，在200倍熒光顯微鏡下，每孔隨機選取5個視野，觀察并計數EdU陽性細胞及總細胞數。通過計算EdU陽性細胞占細胞總數的百分比，明確細胞增殖程度。

1.2.7 Western blotting檢測蛋白表達量 向收集的腎組織/細胞加入裂解液，提取總蛋白，根據Thermo BCA試劑操作手冊測定蛋白濃度；根據測定結果加入相應體積的2×SDS Sample Buffer與蛋白質樣品混勻，水浴鍋95 ℃孵育10 min變性; 利用聚丙稀酰胺凝膠行蛋白電泳，半干法轉膜; 以1∶500的比例稀釋VIL1抗體, 1∶1 000稀釋caspase 3、p21、Bax、p27和β-actin抗體;將相應硝酸纖維素膜條帶置于稀釋好的抗體中4 ℃過夜孵育；采用TBST室溫漂洗膜條帶8 min(共3次)后, 將其放入相應種屬來源的二抗(1∶1 000)中，室溫孵育1 h；孵育后再次使用TBST室溫漂洗8 min×3次；混合足量等體積顯色試劑(A和B)，將膜放于玻璃皿中,向其均勻滴加顯色劑，利用UVP成像系統顯色成像。

1.2.8 統計學分析 應用SPSS 20.0軟件進行統計學分析, 計量資料以x-± s表示, 先進行方差齊性檢驗, 方差齊者2組間數據比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。使用GraphPad Prism 6.0軟件生成圖表。

2 結果

2.1 小鼠腎功能水平比較

HSV-UNX小鼠組血清肌酐水平(16.18±0.87 μmol/L)顯著高于HSV組(52.92±10.74 μmol/L)(P=0.0067); HSV-UNX組小鼠血清尿素氮水平(16.07±0.80 mmol/L)也顯著高于HSV組(26.40±2.32 mmol/L)(P=0.0018)。

2.2 小鼠腎臟病理表現比較

在HSV組小鼠腎臟中，可見彌漫性系膜增殖和細胞外基質積累，無明顯系膜溶解現象；在HSV-UNX組模型中，均可觀察到明顯的系膜溶解現象, 且其增殖表現主要為局部細胞增殖(圖1)。進一步的半定量分析顯示，HSV-UNX組系膜溶解指數(0.100±0.013)與HSV組(0.455±0.025)比較差異顯著(P＜0.01)，系膜增殖指數(1.550±0.054)與HSV組(0.822±0.041)比較差異也顯著(P＜0.01)。上述結果提示，持續的系膜溶解和系膜增殖修復能力減弱可能影響HSV-UNX組小鼠腎小球結構修復，引起腎功能惡化。

2.3 小鼠腎小球中VIL1表達存在差異

與HSV組相比，HSV-UNX組共有413個蛋白表達下調，92個蛋白表達上調(部分差異蛋白相對表達量見表1)，表達下調蛋白較多。在表達下調蛋白中，VIL1為細胞內重要的骨架蛋白，可能參與調節細胞增殖、凋亡過程，故進一步使用Western blotting驗證其腎小球蛋白表達量，結果表明，在HSV-UNX模型中，VIL1表達較HSV組顯著下調(圖2)。

2.4 MMCs中敲低VIL1對細胞增殖及凋亡水平的影響

結果顯示，轉染48 h后，與NC組(對照組)相比，siVIL1組細胞總數顯著減少(圖3A)。Hoechst染色結果提示，與NC組相比，siVIL1組細胞凋亡水平明顯增高(圖3B); EdU試驗表明，siVIL1組細胞增殖水平顯著低于NC組(圖3C)。上述結果表明，敲低MMCs中VIL1的表達，可在促進細胞凋亡的同時降低細胞增殖能力。

2.5 MMCs中敲低VIL1對 caspase 3、Bax、 p21及 p27表達的作用

VIL1低表達可引起caspase 3、Bax、p21及p27蛋白表達水平顯著上調(圖4)。由于 caspase 3、Bax為經典的促凋亡因子, p21及 p27為細胞抑制因子, VIL1可能通過對上述蛋白的調控影響細胞增殖及凋亡能力，更詳細的機制仍需進一步研究。

圖 1 HSV組與HSV-UNX組小鼠腎組織PAS染色結果(400×)Figure 1 Periodinate-schiff staining of kidney in HSV group and HSV-UNX group

表 1 蛋白組學鑒定出的部分差異表達蛋白

圖 2 HSV組與HSV-UNX組腎小球組織VIL1蛋白表達水平檢測Figure 2 The expression level of VIL1 in glomeruli of HSV group and HSV-UNX group detected by Western blotting

3 討論

本研究通過建立HSV腎炎和HSV-UNX腎炎模型，探討二者在疾病進展過程中的差異，并借助蛋白質組學方法尋找可能導致其病程差異的重要分子及其作用機制。本研究結果顯示，與HSV模型相比，HSV-UNX模型腎損傷更嚴重，血清肌酐和血尿素氮水平更高; 同時發現, 在HSV-UNX模型中，系膜溶解程度較HSV模型重，而系膜細胞增殖水平較后者輕。上述病理差異可能在HSV-UNX模型中起到加劇腎功能損傷的作用。

眾所周知, 在系膜增生性腎炎中, 細胞增殖和凋亡的失衡是導致其病理進展的重要原因[1,7,8]。本研究在HSV模型中發現系膜增殖引起腎小球結構重構, 促進了系膜溶解損傷修復。但在HSV-UNX模型中，系膜細胞增殖能力低于HSV模型，但凋亡水平升高，抑制了系膜溶解的修復，導致局部損傷加重。上述結果表明，在HSV-UNX模型中，系膜溶解修復異常是加重其腎功能損害的重要原因。在臨床中，由于各種生理和病理性原因(如先天性“孤獨腎”、腎移植供體、腎腫瘤單側腎切除術、單側尿路梗阻伴腎功能不全等), 許多患者一側腎臟缺如或失去功能, 僅保留單側健康腎臟。在正常情況下, 孤獨腎個體(包括人和動物)的存余側腎臟幾乎無病理性改變[9,10]; 然而, 暴露于有害刺激后, 此類個體罹患腎小球疾病的風險和患病嚴重程度顯著增加[11,12]。本研究中, UNX加重Habu腎炎腎功損傷的現象和病理機制為孤獨腎患者更易罹患腎小球腎炎的學說增添了新的證據, 為其發生發展的機制提供了新的視角。

圖 3 VIL1敲低對MMCs增殖凋亡水平的作用Figure 3 The effect of VIL1 knockdown on the proliferation and apoptosis levels in MMCs

圖 4 VIL1敲低對小鼠MMCs中 caspase 3、Bax、 p21及p27蛋白表達的作用Figure 4 The effects of VIL1 knockdown on expressions of caspase 3, Bax, p21 and p27 in MMCs

為進一步明確HSV-UNX模型中系膜溶解修復異常的分子機制，本研究利用蛋白組學方法分析了2個不同模型在蛋白表達方面的差異，篩選出具有顯著表達差異的蛋白。通過信號通路富集分析，本研究證實2組間差異蛋白主要與細胞增殖和凋亡機制密切相關。如前所述，在腎小球腎炎中, 細胞增殖與凋亡是影響系膜增殖與溶解的關鍵調節因素, 結合2組模型的病理表現差異, 本研究進一步表明, 細胞增殖與凋亡異常是HSV-UNX模型損傷后修復不良及腎功惡化的主要分子機制。此外，本研究還發現，與HSV組相比，VIL1蛋白表達量在HSV-UNX組明顯降低。VIL1是一種細胞骨架蛋白，既往研究表明，VIL1以鈣依賴的方式與肌動蛋白結合[13], 在調節肌動蛋白動力學、維持細胞形態、抗細胞凋亡、細胞增殖和細胞遷移調節和上皮-間質轉化等方面具有重要作用，并可通過上述作用參與肝癌、宮頸癌、結腸癌等疾病的發生發展[14-17]。Decuypere等[18]研究顯示，VIL1與腎小管細胞死亡密切相關，是急性腎損傷的新型預測因子，但尚未有VIL1在腎小球疾患中作用及機制的研究。本研究則證實，在系膜細胞中, 敲除VIL1可增加p21、p27、Bax和caspase 3的表達, 抑制細胞增殖, 促進細胞凋亡。眾所周知, p21和p27是細胞周期的負調控因子[19],二者可與周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases, CDKs)家族中CDK2/4/6結合并發揮抑制作用，從而使細胞周期阻滯于G1期，抑制細胞增殖。此外，Bax和p21可通過激活caspase 3誘導線粒體相關細胞凋亡[20]。既往研究顯示，VIL1在其headpiece域中有一個F-actin結合位點，可以結合并切斷F-actin[13]，而VIL1的下調可能通過與F-actin相互作用來調控p21、p27、Bax和caspase 3等蛋白表達[21-22]，進而影響p53、ERK和AKT信號通路[23-25]。這些信號通路的異常最終可引發系膜細胞增殖和凋亡失衡。因此, VIL1的下調可能通過抑制系膜細胞增殖及促進細胞凋亡,導致系膜溶解修復障礙，最終在UNX術后Habu腎炎模型的腎功能損傷加劇中發揮重要作用。

綜上所述，與HSV模型相比，HSV-UNX模型中加劇的系膜溶解和局灶性系膜增生加重了腎功能損害，其中，VIL1在HSV-UNX模型表達下調可能通過抑制細胞增殖和促進細胞凋亡導致腎小球自我修復能力下降，加重腎功能損害。本研究為孤獨腎狀態下腎小球腎炎進展加劇的學說增添了新的證據，并提出了可能的分子機制，上述結果對于改善腎小球腎炎進展率、防治特殊人群腎小球腎炎具有潛在應用價值。