大孔樹脂初步純化美洲合歡花花色苷

余亞選，秦飛，陳仲巍，紀美茹

廈門醫學院（廈門 361023）

美洲合歡花（Calliandra haematocephala）又名朱櫻花、美蕊花，除作為綠化觀賞植物外[1]，還具有一定的藥效。現代研究表明，美洲合歡葉中含有黃酮及其苷類、苯丙素類、4, 5-二羥基-1-哌啶酸等化合物，這些提取物具有抗氧化、抗炎、殺菌等作用[2-4]。通過前期研究[5]，發現美洲合歡花富含大量花色苷。

花色苷是花青素與糖類物質以糖苷鍵結合的一類化合物，廣泛存在于自然界中的蔬菜、水果等植物中。花色苷具有一系列生物活性，可抗氧化[6-7]、消除自由基、延緩衰老、抗炎、抗腫瘤[8-9]、降低血糖[10]、增強人體免疫功能等[11]，國內外將其應用到食品、化妝品、藥品等多個領域。由于植物經過溶劑浸提法提取得到的花色苷通常含有糖、蛋白質及其他非花色苷類等雜質，這會影響花色苷的性質和應用，因此提取純化活性花色苷類物質對于保健食品及藥物的研發具有重要的現實意義。大孔吸附樹脂是一類有機高分子聚合物吸附劑，通過吸附性和分子篩原理將具有一定極性的有機大分子物質進行分離。與現有的天然色素分離方法相比，因其具有吸附量大、吸附速度快、洗脫率高且能夠再生使用等優點，因此被廣泛應用于酚類、黃酮、色素等物質的吸附純化研究中[12-14]。

文獻檢索未見美洲合歡花花色苷的相關研究報道，因此試驗對美洲合歡花花色苷進行提取、純化，對比8種大孔樹脂對美洲合歡花花色苷純化效果，重點研究大孔樹脂D101純化花色苷工藝，為美洲合歡花資源的發展、評價及利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

美洲合歡花，采摘于福建廈門集美區灌口鎮，經廈門醫學院鮑紅娟副教授鑒定為豆科植物美洲合歡（Calliandra haematocephala）花冠；鹽酸、無水乙醇、氫氧化鈉、乙腈、甲酸等（國藥集團化學試劑有限公司，分析純）；大孔樹脂D101、AB-8、HPD-100、HPD-100A、HPD-200A、HPD-300、HPD-500、HPD-600（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）。

N-1210B型旋轉蒸發儀（EYELA）；SQP型電子分析天平、PB-10型pH計（德國賽多利斯儀器有限公司）；UV-1780型紫外-可見分光光度儀、Nexera X2 LC-30AD型高效液相色譜儀、Shim-pack XR-ODS Ⅲ色譜柱（75 mm×2.0 mm，1.6 μ m）（島津）。

1.2 試驗方法

1.2.1 花色苷的提取[5]

預處理：采摘后60 ℃烘干過夜，粉碎機進行磨粉處理，過40目篩，于干燥器中避光保存備用。準確稱取1.000 g樣品加入70 mL 60%乙醇溶液，通過6 mol/L鹽酸溶液調至pH 2.0，于60 ℃水浴中回流60 min，抽濾，取濾液稀釋至適當倍數，用紫外可見分光光度計于400～800 nm下進行光譜掃描，確定美洲合歡花色苷的最大吸收波長。將濾液置于40 ℃下真空濃縮，旋蒸至干后，冷凍干燥得到花色苷粗提樣品，密封，避光下至于5 ℃冰箱中冷藏備用。

1.2.2 大孔樹脂的篩選

1.2.2.1 大孔樹脂的預處理

將大孔樹脂D101、AB-8、HPD-100、HPD-100A、HPD-200A、HPD-300、HPD-500、HPD-600用95%乙醇浸泡過夜使其充分溶脹后，倒去上層液體，用蒸餾水洗至無醇味，依次用5% NaOH溶液浸泡后蒸餾水洗至中性，5% HCl溶液浸泡后蒸餾水洗至中性，備用。

1.2.2.2 大孔樹脂的靜態吸附率和解吸率比較測試

準確稱取預處理好的8種供試大孔樹脂各1.000 g（使用前用濾紙吸干樹脂表面的水分）于錐形瓶中，加入25 mL美洲合歡花花色苷粗提液（質量濃度1.5 mg/mL、pH 2.0），在25 ℃、150 r/min水浴條件下振蕩24 h至吸附平衡后過濾，測定濾液中花色苷吸光度，計算各樹脂的吸附率。向吸附平衡樹脂加入60%乙醇25 mL（鹽酸調pH 2.0），振蕩24 h后過濾，測定濾液中的花色苷吸光度，計算解吸率。

式中：A0為吸附前花色苷溶液吸光度；A1為吸附后花色苷溶液吸光度；A2為解吸后花色苷溶液吸光度。

1.2.3 大孔樹脂D101靜態吸附及解吸試驗

1.2.3.1 吸附平衡時間的測定

準確稱取5.000 g大孔樹脂D101于錐形瓶中，加入125 mL美洲合歡花花色苷粗提液（質量濃度1.5 mg/mL、pH 2.0），在25 ℃、150 r/min水浴條件下振蕩，每隔0.5 h取樣測定溶液吸光度，計算吸附率。

1.2.3.2 解吸平衡時間的測定

準確稱取吸附飽和樹脂5.000 g于錐形瓶中，加入pH 2.0，60%乙醇溶液125 mL，在25 ℃水浴條件下振蕩，每隔0.5 h取樣測定溶液吸光度，計算解吸率。

1.2.3.3 上樣濃度對大孔樹脂吸附能力的影響

準確稱取6份1.000 g大孔樹脂D101于錐形瓶中，分別加入質量濃度為0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75，2.00，2.25和2.50 mg/mL（鹽酸調pH 2.0）花色苷粗提液25 mL，在25 ℃、150 r/min水浴振蕩4 h至吸附平衡后抽濾，測定濾液中花色苷吸光度，計算吸附率。

1.2.3.4 溶液pH對大孔樹脂吸附能力的影響

準確稱取6份1.000 g大孔樹脂 D101于錐形瓶中，分別加入pH 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0花色苷粗提液25 mL（質量濃度1.5 mg/mL），在25 ℃、150 r/min水浴條件下振蕩4 h至吸附平衡后抽濾，測定濾液中花色苷吸光度，計算吸附率。

1.2.3.5 乙醇濃度對大孔樹脂解吸能力的影響

準確稱取6份吸附飽和樹脂1.000 g于錐形瓶中，分別加入30%，40%，50%，60%，70%和80%乙醇溶液（鹽酸調pH 2.0）25 mL，在25 ℃、150 r/min水浴條件下振蕩6 h后測定溶液吸光度，計算解吸率。

1.2.3.6 溶液pH對大孔樹脂解吸能力的影響

準確稱取6份吸附飽和樹脂1.000 g于錐形瓶中，分別加入pH 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0的60%乙醇溶液25 mL，在25 ℃水浴條件下振蕩6 h后測定溶液吸光度，計算解吸率。

1.2.4 大孔樹脂D101動態吸附及解吸試驗

1.2.4.1 上樣流速對大孔樹脂吸附和能力的影響

稱取一定量樹脂D101，濕法裝柱，用恒流泵控制不同的流速（1，2和3 mL/min），使花色苷粗提液上柱吸附，用自動部分收集器以每管10 mL收集流出液，流出液在530 nm波長處吸光度達到花色苷原液吸光度的10%時，記錄泄漏點（V，mL）。

1.2.4.2 洗脫流速對解吸率的影響

按照確定的泄漏點上樣完成后，依次分別用蒸餾水和pH 2.0的鹽酸溶液洗脫吸附柱，以便除去可溶性的糖、蛋白質及其他小分子物質。用pH 2.0、60%乙醇溶液以不同的速度洗脫（1，2和3 mL/min），利用自動收集器收集洗脫液，每5 mL收集1管，測定吸光度。

1.2.5 HPLC分析純化前后美洲合歡花花色苷提取物

對純化前后花色苷進行成分分析，HPLC分析條件：Shim-pack XR-ODS Ⅲ色譜柱（75 mm×2.0 mm，1.6 μm），柱溫25 ℃。流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）。梯度洗脫：0～20 min，0～50% A；20～30 min，50%～0 A。檢測波長530 nm，體積流量0.5 mL/min，進樣量10 μL，樣品濃度1 mg/mL。

1.3 數據處理

試驗進行3次重復試驗，結果取平均值，并采用Graphpad prism 6.0軟件對試驗數據進行處理。

2 結果與討論

2.1 美洲合歡花花色苷最大吸收波長的確定

研究表明，花色苷特征吸收峰在500～540 nm[15]。美洲合歡花400～800 nm吸收波長下的吸收光譜圖如圖1所示，美洲合歡花花色素最大吸收波長為530 nm，可見該色素為花色苷類，因此以530 nm作為檢驗波長。

圖1 美洲合歡花花色苷吸收光譜圖

2.2 大孔樹脂的篩選

8種不同的大孔樹脂分別吸附美洲合歡花花色苷粗提液（pH 2.0），吸附時間24 h；樹脂解吸條件為60%、pH 2.0的乙醇溶液。吸附和解吸平衡后結果見表1。結果表明，除HPD-100外，其他幾種樹脂的吸附能力均在90%以上，差異不大。但解吸方面，D101的解吸率最大，高達81.58%，綜合考慮，在后續試驗中采用D101樹脂。

表1 不同樹脂的吸附和解吸性能比較

2.3 大孔樹脂D101靜態吸附及解吸試驗結果

2.3.1 吸附平衡時間

由圖2可知，在前3 h過程中D101樹脂對美洲合歡花花色苷的吸附率隨著時間延長呈明顯上升趨勢，尤其是初始的1 h速率最大，吸附率達63%，隨后吸附速率逐漸降低。大約在4 h吸附率達93%，繼續增加吸附時間，吸附率基本保持穩定，樹脂與花色苷之間的作用達到動態平衡，吸附達到飽和，因此以4 h為最佳吸附時間。

圖2 D101樹脂對花色苷的靜態吸附曲線

2.3.2 解吸平衡時間

圖3為60%酸化乙醇（pH 2.0）溶液對花色苷的解吸曲線，洗脫前2 h內，乙醇溶液對吸附在樹脂上的花色苷解吸能力較強，解吸率增加較快，尤其在解吸30 min時，解吸率達59%。之后隨著解吸時間延長，洗脫速率降低，解吸率增加變緩。解吸3 h后，溶液中花色苷濃度基本變化不大，這是因為此時乙醇溶液、大孔樹脂對花色苷的作用達到動態平衡，解吸率變化甚微，解吸過程基本完成。因此，解吸完成時間為3 h，此時解吸率為78%。

圖3 D101樹脂對花色苷的靜態解吸曲線

2.3.3 上樣濃度對吸附率的影響

由圖4可知，D101樹脂對美洲合歡花花色苷的吸附率隨著上樣濃度增加先增大后減小，樣品質量濃度為1.5 mg/mL時，吸附率達到最大，吸附達到飽和狀態。這是因為花色苷液質量濃度過低時，吸附時間長，且質量濃度過低造成吸附動力小，導致吸附量低[16]。質量濃度過高時，雜質吸附率增加，與花色苷競爭吸附的分子增多，花色苷分子不能與大孔樹脂內表面充分交換吸附，造成吸附率降低[17]。

2.3.4 吸附液pH對吸附率的影響

由圖5可知，D101大孔樹脂對美洲合歡花中花色苷的吸附率隨著樣液pH增大先增加后減小，pH 2.0時吸附效果最佳，這是因為花色苷在不同pH下有不同存在形式，酸性條件下，花色苷大多以分子形式存在，易被樹脂吸附，而隨著酸性減弱，以分子形式存在的花色苷變少，影響吸附效果[18]。因此pH 2.0為最佳樣液pH。

圖4 樣品質量濃度對吸附效果的影響

圖5 吸附液pH對花色苷吸附效果的影響

2.3.5 洗脫劑濃度對解吸率的影響

由圖6可知，D101大孔樹脂對花色苷的解吸率隨洗脫劑乙醇體積分數的增加呈增大趨勢，乙醇體積分數60%時，解吸率達80%以上。但繼續增加乙醇體積分數，大孔樹脂對花色苷的解吸率增大很不明顯，這是因為低體積分數的乙醇溶液極性偏大，不能將大孔樹脂中的花色苷充分解吸，因此解吸效果差。但是繼續增加乙醇體積分數，大孔樹脂對花色苷的解吸率增大很不明顯，這可能是因為濃度過大會造成醇溶現象，不利于解吸[19-20]，再加上從成本和環境綜合因素考慮，選擇60%乙醇作為美洲合歡花花色苷的洗脫溶劑。

2.3.6 解吸液pH對解吸率的影響

由圖7可知，解吸液pH對D101吸附花色苷的解吸影響較大，pH 1.0～2.0時，解吸率有所增加，但pH繼續增加后，解吸率反而降低，pH 2.0時，解吸率最好，可能是因為pH小于2.0時，被解吸出來花色苷結構遭到破壞，而pH大于2.0時，花色苷不能完全充分解吸，使解吸率有所下降[19]。因此選擇pH 2.0為最佳洗脫條件。

圖6 乙醇體積分數對花色苷解吸率的影響

圖7 解吸液pH對花色苷解吸效果的影響

2.4 大孔樹脂D101動態吸附及解吸

2.4.1 上樣流速對吸附效果的影響

一般認為流出液濃度為上樣初始濃度的10%時為泄漏點，此時樹脂對溶質吸附趨向飽和。由圖8可知，隨著花色苷粗提液流出體積增加，流出液的吸光度也逐漸增加，樹脂吸附飽和，繼續增加花色苷體積，花色苷出現泄漏。選擇上樣質量濃度1.5 mg/mL（吸光度A=1.414）的花色苷溶液進行進行試驗，上樣流速3 mL/min時，流出液體積310 mL時就開始出現泄漏，較早浪費花色苷溶液，這是因為流速過快，花色苷分子無法與樹脂充分接觸，而直接隨上樣液的流動而泄漏[20]；上樣流速1 mL/min時，流出液體積510 mL時才開始出現泄漏，但是考慮上樣速度過慢影響吸附效率，最終確定流速2 mL/min為佳。

圖8 上樣流速對動態吸附效果的影響

2.4.2 洗脫流速對解吸效果的影響

由圖9可知，收集洗脫液吸光度均為先增大后減小，洗脫流速1 mL/min時的吸光度峰值最大，洗脫峰相對集中，對稱性好且無明顯拖尾情況；流速3 mL/min時的吸光度峰值最小，最后降到最低值，且有拖尾現象，這是因為洗脫速度過快，洗脫劑來不及與樹脂充分接觸，就直接流出吸附柱。所以，洗脫流速1 mL/min時的解吸附效果最好。

圖9 洗脫流速對解吸效果的影響

2.5 HPLC檢測結果

通過使用液相色譜法對比純化前后花色苷，結果如圖10所示。結果表明，純化后的花色苷經過高效液相色譜檢測后，雜峰變少，峰值有顯著提高，表明經過大孔吸附樹脂純化過的花色苷純度明顯有所提高。

圖10 純化前后花色苷液相色譜圖

3 結論

通過靜態吸附-解吸試驗，對D101、AB-8、HPD-100、HPD-100A、HPD-200A、HPD-300、HPD-500和HPD-600這8種大孔樹脂進行了篩選，得到D101樹脂對美洲合歡花花色苷的吸附-解吸效果最佳。美洲合歡花花色苷吸附解吸的最優工藝條件為：上樣質量濃度1.5 mg/mL、pH 2.0、洗脫液采用60%酸化乙醇、上樣液流速2 mL/min、洗脫流速1 mL/min。HPLC檢測發現，經過大孔吸附樹脂純化過的花色苷純度明顯有所提高。