正交試驗優化染料木素-鋅配合物合成工藝

王有娣，馮鈺舒，唐旗羚，賀彥，鐘銘君，徐娟娟

中山大學新華學院藥學院（廣州 510520）

染料木素（結構見圖1）作為一種植物雌激素，主要存在于豆科植物中，如大豆、槐角、赤豆、山豆根中。

圖1 染料木素結構圖

有研究表明染料木素具有雌激素性質，可以抗氧化、誘發細胞程序性死亡、提高抗癌藥效、抑制血管生成等[1-2]。作為一種癌癥的潛在化學預防劑，染料木素抗癌作用及機制具有廣泛的應用前景[3]。有研究指出，染料木素與金屬離子形成配合物后可以提高其生物利用度，增強其抗癌、抗氧化等活性[4-5]。課題組前期已經對染料木素及其鋅配合物對乳腺癌和肺癌的體外抗癌活性進行了研究，結果顯示染料木素及其配合物對乳腺癌和肺癌均有良好的抗癌活性。根據目前已有的文獻來看，染料木素-鋅配合物的研究雖已有報道，但采用正交試驗優化染料木素-鋅配合物合成工藝還鮮見報道，故試驗利用正交試驗優選出染料木素-鋅配合物的合成工藝條件，為天然產物染料木素的進一步開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

集熱恒溫加熱磁力攪拌器（DF-1015型，鄭州長城科工貿）；紫外可見分光光度計（UV-2201，日本島津公司）；傅里葉紅外光譜儀（Nicolet 5700，美國Thermo Nicolet）；電子天平（AUY120型，日本島津公司）。

染料木素購自南京狄格爾醫藥科技有限公司（產品批號D2017042503A，純度為99.8%），無水乙醇、醋酸鋅、三乙胺等試劑均為分析純。

1.2 方法

稱取染料木素，用10倍量的無水乙醇作為反應溶劑，加熱溶解，待染料木素完全溶解后，加入三乙胺調節反應pH，待反應pH穩定，加入醋酸鋅，控制反應溫度，回流攪拌一定時間，反應結束后，將反應液冷卻至室溫，以3 000 r/min離心2 min，沉淀用50%乙醇洗滌，洗滌3次后，于60 ℃烘干，稱質量，計算配合物產率。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 反應溫度的確定

一般而言，升高溫度可以加快反應速度，由于溫度太高可能會影響染料木素和金屬離子的配位能力，也可能使反應溶劑（即無水乙醇）因為溫度過高而沸騰。如圖2所示，隨著溫度的升高，染料木素-鋅配合物產率也隨著增加，當溫度在60 ℃時，產率最高，之后隨著溫度的升高，產率呈降低的趨勢。因此選擇最佳合成反應溫度為60 ℃。

圖2 反應溫度對產率的影響

2.1.2 反應pH的確定

根據文獻報道黃酮類化合物在堿性條件下較容易與金屬離子進行配合反應，但反應pH過高可能會導致金屬離子沉淀等問題[6]，故選用反應pH 7.0～11.0進行試驗。由圖3可知，隨著pH的增大，染料木素-鋅配合物的產率增加，當反應pH為9.0時染料木素鋅配合物產率最高。此后，隨著pH的增加，染料木素-鋅配合物產率反而下降。因此選擇最佳合成反應pH為9.0。

圖3 反應pH對產率的影響

2.1.3 反應時間的確定

如圖3所示，增加反應的時間，隨著反應的逐漸完全，染料木素-鋅配合物的產率升高，當反應時間在6 h時所得染料木素鋅配合物產率最高，繼續延長反應時間，染料木素-鋅配合物的產率開始下降。因此選擇最佳合成反應時間為6 h。

2.2 正交試驗設計結果

根據單因素試驗的結果，選擇反應溫度（A）、反應pH（B）、反應時間（C）三個因素作為考察的因素，每個因素選取三個水平，以染料木素鋅配合物產率為衡量指標。因素水平表見表1。

圖4 反應時間對產率的影響

表1 正交試驗因素水平表

采用L9(34)進行正交試驗，正交試驗結果見表2，方差分析表見表3。從表2正交試驗直觀分析結果可以看出，各因素對配合物產率的影響程度不同，三個因素對產率的影響由大到小依次為反應pH（B）＞反應溫度（A）＞反應時間（C）。從表3方差分析結果可以看出，三個因素對產率均無顯著性影響。結合直觀分析和方差分析結果，篩選出的染料木素鋅配合物的最優合成方案為B2A2C2，即稱取染料木素，用10倍量的無水乙醇溶解，60 ℃加熱至完全溶解后滴加三乙胺，調節pH 9.0，pH穩定后加入醋酸鋅，控制反應溫度為60 ℃，回流攪拌6 h。

表2 L9(34)正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析結果

2.3 合成工藝的驗證

根據正交試驗的結果，在最優的合成工藝B2A2C2條件下進行3次平行試驗，通過配合物的產率驗證最優合成工藝的可行性和合理性。試驗結果顯示，用反應pH 9.0、反應溫度60 ℃、反應時間6 h的B2A2C2反應方案合成染料木素-鋅配合物，產率為39.67%，合成得到的染料木素-鋅配合物為淡黃色粉末。

2.4 染料木素-鋅配合物的紫外光譜分析

將染料木素配體和染料木素-鋅配合物進行紫外光譜分析，紫外光譜數據見表4。染料木素的特征紫外吸收峰為帶Ⅰ352 nm和帶Ⅱ269 nm，染料木素-鋅配合物的兩個吸收峰均向長波方向移動至381和299 nm。主要原因可能是染料木素和鋅形成配合物是通過4位羰基、5位羥基和金屬鋅形成配位鍵，整個配合物分子的平面型增強，增大了共軛體系，故吸收帶Ⅰ和Ⅱ會發生紅移。紫外光譜結果可初步證明染料木素分子中的4位羰基和5位羥基參與了金屬配位。

表4 染料木素-鋅配合物的紫外光譜數據 nm

2.5 染料木素-鋅配合物的紅外光譜分析

將染料木素配體和染料木素-鋅配合物進行紅外光譜分析，其紅外光譜數據見表5。染料木素的羥基吸收峰在3 411 cm-1左右，而鋅配合物的羥基吸收峰移動至3 380 cm-1左右，原因可能是由5-OH參與配位引起的。染料木素的4位羰基峰在1 653 cm-1左右，而鋅配合物的4位羰基峰在1 642 cm-1左右，向低波數移動，可能是由于4位羰基也參與了配位。與配體染料木素相比，配合后化合物在460 cm-1左右新增加了一個吸收峰，推測該峰可能是由金屬Zn與O形成的Zn-O鍵伸縮振動引起的。紅外光譜結果也可說明染料木素分子中的4位羰基和5位羥基參與了金屬配位。

表5 染料木素-鋅配合物的紅外光譜數據

3 討論

植物雌激素具有雌激素激動劑和阻斷劑效應，對乳腺癌、前列腺癌、心血管病變等激素相關疾病的預防和治療有良好的作用[7]。染料木素是一種異黃酮類的植物雌激素，課題組前期已經研究了染料木素及其鋅配合物對乳腺癌和肺癌的體外抗癌活性，結果顯示染料木素及其配合物對乳腺癌和肺癌均有良好的抗癌活性，且染料木素-鋅配合物的抗癌活性高于其配體染料木素[8]。

由染料木素本身的結構以及試驗前的pH試紙測定顯示，染料木素呈酸性，故染料木素在酸性環境中較穩定，與金屬離子配位的能力較差，容易造成產率較低的問題。在強堿性條件下，染料木素與金屬離子反應形成配合物的能力強，但堿性過強則容易造成染料木素的開環或者氧化，同時如果反應環境的pH過高也容易造成金屬離子的沉淀。因此，綜合考慮各種因素確定最終選定染料木素-鋅配合物的合成pH范圍為7.0～11.0，試驗的結果也證明在pH 9.0時，反應產率最高。通過對正交試驗結果的分析可知，影響產率的主要因素依次為pH（B）＞反應溫度（A）＞反應時間（C），主要因素應取最好的水平，而次要因素則可根據成本、時間等方面考慮，由此得到各因素的最佳搭配為B2A2C2，即反應pH為9.0、反應溫度為60 ℃、反應時間6 h。

4 結論

采用正交試驗考察了不同因素對染料木素-鋅配合物產率的影響。結果顯示，染料木素-鋅配合物的最佳合成工藝為：反應pH 9.0、反應溫度60 ℃、反應時間6 h。在此條件下染料木素-鋅配合物的平均產率可達39.67%。同時試驗分析結果表明，三個影響因素中反應環境的pH對合成產率影響最大。對比染料木素與醋酸鋅配合前后的紫外光譜和紅外光譜可知，染料木素是通過4位羰基和5位羥基與鋅金屬離子進行配位的。