豬胰臟中胰淀粉酶的提取及其穩定性

岳曉禹，陳貴敏

河南牧業經濟學院食品與生物工程學院（鄭州 450046）

在科學技術進步、能源發展、綠色環保等影響下，綠色健康、動物副產品產業取得發展，并不斷擴大，畜產品加工成為農村小康生活進步、國家經濟發展、實現綠色環境和綠色食品開發的途徑。利用高新技術，特別是生物分離、酶工程、發酵、高壓、高真空處理技術的進步，促進畜產品生產和市場的需求[1]。胰腺作為畜牧業的副產品，具有很高的利用價值。胰腺中可以分泌胰島素平衡體內血糖量和蛋白酶、淀粉酶等分解碳水化合物、蛋白質、脂肪的酶。淀粉酶作為一種大型工業原料，主要應用的是水解產物葡萄糖、麥芽糖、低聚糖糖漿等，這些水解后的糖漿將被用于酒精發酵、醬油制作等，或直接作為產品用于其他領域（面包保鮮、醫療、洗滌劑）[2]。基于中國淀粉行業的發展需求，淀粉酶是中國需求量最大的酶。α-淀粉酶分布在自然界各種動物、植物、微生物體內中[3]。微生物與動植物比較，微生物繁殖速度快，外界影響易去除，而動植物則不同，受大自然的影響，繁殖速度慢，外界影響大，所以應市場需求量大部分淀粉酶是從微生物中提取。隨著科技進步，細胞重組、DNA重組等技術促進動植物繁殖的速度，動植物提取淀粉酶成為越來越常使用的原料。

文獻報道的提取胰淀粉酶的方法主要是機溶劑和鹽析法結合的方法，如異丙醇沉淀和不同濃度銨鹽溶液鹽析結合的方法[4]、不同濃度硫酸銨鹽析和凝膠層析法[5]。隨著科技進步，環境惡化，有機溶劑和鹽析法帶來的危害受到重視。有文獻報道使用低濃度的有機溶劑（35%～38%稀乙醇[6]）和鹽溶液（磷酸鹽緩沖液[7]）提取工藝。胰酶提取主要還是使用有機溶劑（乙醇、丙酮）和鹽析法提取；有機溶劑不僅危險而且污染環境、成本高，鹽析法除鹽困難、對產品質量有影響等弊端[8]。所以，需要研究開發一種綠色環保、高質量、高品質的提取α-淀粉酶工藝[9]。如何提取高活力的α-淀粉酶具有重要的實際意義。中國生豬加工行業發展巨大，能提供大量原料。

試驗以豬胰臟為原料，減少或盡量不用有機溶劑做提取劑，從胰臟中提取α-淀粉酶，使用透析袋對α-淀粉酶進行反滲透濃縮，向提取的液體酶中加入穩定劑配方，使液體酶在高溫下仍能保持α-淀粉酶的酶活力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑

豬胰臟（鄭州雙匯集團）；氫氧化鈉（天津市永大化學試劑有限公司）；氯化鈣（天津市科密歐化學試劑有限公司）；馬鈴薯淀粉（菱湖）、碘（天津永大化學試劑有限公司）；碘化鉀（天津永大化學試劑有限公司）；硫代硫酸鈉（鄭州派尼化學試劑廠）；鹽酸（煙臺市雙雙化工有限公司）；硫酸（煙臺市雙雙化工有限公司）；碳酸鈣（天津市科密歐化學試劑有限公司）等。

1.1.2 設備與儀器

磁力攪拌器、離心機、恒溫水浴鍋HH-S（江蘇醫療儀器廠）；干燥箱；絞肉機（PY-790，中山市鵬宇電器有限公司）；酸度計（上海儀邁儀器科技有限公司）；全溫培養搖床（QYC-2102，上海新苗醫療器械制造有限公司）；移液槍（規格100～1 000 μL）；細菌培養箱（SPX-250L-B-1，上海福馬實驗設備有限公司）；透析袋（20000，美國）等。

1.2 工藝流程與部分操作要點

胰臟（凍藏）→預處理→提取→過濾→胰乳濾液→粗酶→濃縮→保存

1) 預處理

將新鮮豬胰或冷凍豬胰臟除去大塊脂肪，用絞肉機制成胰漿。

2) 提取

取10 g胰漿，加入20 mL（按1∶2比例）不同試劑，磁力攪拌1 h，2層紗布過濾，得到濾液，濾渣再次提取，2次濾液合并。

3) 濃縮

酶的純度越高酶活越高，采用透析濃縮的方法，對胰淀粉酶進行濃縮提純，并研究濃縮對胰淀粉酶活力的影響，確定最佳濃縮倍數。

4) 保存穩定性的研究

采用向胰淀粉酶中加入穩定劑、改變溫度或pH等因素對胰淀粉酶的穩定性影響，找出可以長期穩定性保存的方法。

1.3 胰淀粉酶提取過程試驗設計

1.3.1 單因素試驗設計

1) 提取劑對胰淀粉酶酶活力的影響

準確稱取10 g豬胰漿4份，置于干凈已標記好的燒杯中，分別加入提取劑為：磷酸鹽緩沖液、氯化鈉溶液、水、澄清石灰水，攪拌均勻，調節各個提取劑pH 6.8、溫度25 ℃、磁力攪拌器攪拌1 h，2層紗布過濾，得胰乳，2次提取，2次提取液合并。測定胰淀粉酶活力，試驗重復至少3次，確定最佳提取劑。

2) 提取pH胰淀粉酶酶活力的影響

準確稱取10 g豬胰漿6份，置于干凈已標記好的燒杯中，分別加入提取劑澄清石灰水，攪拌均勻，調節pH分別為6.5，6.6，6.7，6.8，6.9和7.0，常溫下，磁力攪拌器攪拌1 h，2層紗布過濾，得胰乳，2次提取，2次提取液合并。測定胰淀粉酶活力，試驗重復至少3次，確定最佳提取pH。

3) 提取時間胰淀粉酶酶活力的影響

準確稱取10 g豬胰漿4份，置于干凈已標記好的燒杯中，分別加入提取劑澄清石灰水，攪拌均勻，調節最佳pH 6.8，常溫下，磁力攪拌器攪拌時間分別為1，2，4和6，2層紗布過濾，得胰乳，2次提取，2次提取液合并。測定胰淀粉酶活力，試驗重復至少3次，確定最佳提取時間。

4) 提取溫度胰淀粉酶酶活力的影響

準確稱取10 g豬胰漿7份，置于干凈已標記好的燒杯中，分別加入提取劑澄清石灰水，攪拌均勻，調節最佳pH 6.8，調節溫度4，15，25，30，35，40和45 ℃，最佳磁力攪拌器攪拌2 h，2層紗布過濾，得胰乳，2次提取，2次提取液合并。測定胰淀粉酶活力，試驗重復至少3次，確定最佳提取溫度。

1.3.2 正交試驗設計

根據單因素試驗設計結果，選擇提取pH、提取時間、提取溫度、提取劑4個因素。每個因素選擇3個水平。設計正交試驗，采用L9(34)正交試驗設計，確定最佳提取工藝。正交試驗設計水平表如表1。

表1 豬胰淀粉酶提取單因素正交試驗水平表

1.4 胰淀粉酶活力測定

《中國藥典》2015版，胰淀粉酶活力測定。

1.5 試驗數據處理方法

數據處理方法采用SPSS軟件進行方差分析和多重比較的方法，判斷是否顯著的方法，用字母表示法表示，在表格中，在0.01水平上數據上肩注A、B、C等表示，0.05水平上數據上肩注a、b、c表示。只要同一列平均數間有一個相同字母的即為差異不顯著；凡是無相同字母的則為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取劑對胰淀粉酶酶活力的影響

有機溶劑污染環境、鹽析影響酶的質量[8]。所以提取劑采用磷酸鹽緩沖液[7]、氯化鈉[10]、水[11]、澄清石灰水[12]為提取劑，減少有機溶劑的使用和鹽含量。表2可知，提取劑為磷酸鹽緩沖液、氯化鈉、水時，胰淀粉酶酶活力沒有明顯差異（p＞0.05），提取劑為水、澄清石灰水時，胰淀粉酶酶活力明顯增加（p＜0.05）。澄清石灰為提取劑時，胰淀粉酶活力最高。所以，最佳提取劑為澄清石灰水。

表2 提取劑對胰淀粉酶酶活力的影響

2.1.2 提取pH對胰淀粉酶酶活力的影響

胰淀粉酶的最適pH范圍為6.5～7.0，最適pH 6.9[4]。但豬胰臟本身都存在pH，所以探究不同pH提取對有胰淀粉酶活力的影響。有表3可知，pH 6.5～6.8時，胰淀粉酶活力增高極顯著（p＜0.05）。pH 6.8～6.9時，胰淀粉酶活力明顯下降（p＜0.05）。pH 6.9～7.0時，胰淀粉酶活力沒有明顯變化（p＞0.05）。因為pH 6.8時，酶活力值最高。所以，最適pH 6.8。

表3 提取pH對胰淀粉酶酶活力的影響

2.1.3 提取時間對胰淀粉酶酶活力的影響

由表4可知，提取時間1～2 h時，胰淀粉酶活力急劇升高（p＜0.05），提取時間2～6 h時，胰淀粉酶活力急劇下降（p＜0.05）。說明提取時間對胰淀粉酶活力極為重要。

表4 提取時間對胰淀粉酶酶活力的影響

2.1.4 提取溫度對胰淀粉酶酶活力的影響。

酶作為一種生物催化劑，其半衰期短，易失活，嚴重影響酶的使用。所以提取時溫度過高過低會對胰淀粉酶活力產生影響。對提取溫度做出研究。由表5可知，不同溫度下提取胰淀粉酶差異極顯著（p＜0.01），提取溫度為4～40 ℃時，胰淀粉酶活力變化明顯（p＜0.01），溫度40 ℃時，胰淀粉酶活力到達最高值，溫度再次升高至45 ℃時，胰淀粉酶活力急劇下降（p＜0.01），說明提取溫度對胰淀粉酶活力極為重要。因為40 ℃時胰淀粉酶活力達到最高值，所以最適提取溫度為40 ℃。

表5 提取溫度對胰淀粉酶酶活力的影響

2.1.5 正交試驗結果

根據表1豬胰淀粉酶提取單因素正交試驗水平表）所得表6（豬胰淀粉酶提取單因素正交試驗方案）。

由單因素結果表明，提取劑采用澄清石灰水、磷酸鹽緩沖液、水；提取pH 6.8～7.0；提取溫度30～40℃；提取時間1～4 h，通過L9(34)正交試驗確定最佳的提取工藝。根據表6的數據顯示，影響胰淀粉酶活力的因素主次為：提取劑＞提取pH＞提取溫度＞提取時間。通過極差分析得到的優化方案為A1B2C1D3，即：提取劑采用磷酸鹽緩沖液，提取pH 6.8，提取時間2 h，提取溫度30 ℃。

表6 豬胰淀粉酶提取單因素正交試驗方案

根據正交試驗結果，提取劑采用磷酸鹽緩沖液、提取pH 6.8、提取時間2 h，提取溫度30 ℃進行工藝驗證，驗證結果表明，胰淀粉酶酶活力為1 375.00 U/mL，比表6（豬胰淀粉酶提取單因素正交試驗方案）中提取工藝的胰淀粉酶酶活力都要高，所以提取劑采用磷酸鹽緩沖液、提取pH 6.8、提取時間2 h，提取溫度30 ℃為最佳工藝。

2.2 透析濃縮的影響

用30%聚乙二醇20000溶液進行反滲透濃縮，透析液2～3 h后換透析液：第1次透析，胰淀粉酶記為酶2；5～6 h后再次換透析液，記為第2次透析，胰淀粉酶記為酶3；換完透析液后將樣液放入4 ℃條件下，進行過夜透析，過夜透析后的酶為記為酶3；經過過夜透析后的胰淀粉酶小分子物質已透析完全，胰淀粉酶記為酶4；提取后的胰淀粉酶記為酶1。如圖1所示。

結果表明，酶在透析濃縮過程中胰淀粉酶酶活力越來越高，隨著透析次數增加，酶4平均胰淀粉酶酶活力是酶1平均胰淀粉酶酶活力的5.2倍。

圖1 不同程度透析濃縮對酶活力的影響

2.3 穩定保存的確定

加入穩定劑配方，放在35 ℃恒溫培養箱內，每隔一段時間測1次酶活，觀察胰淀粉酶酶活力變化，因為胰淀粉酶是液體酶，在高于常溫下液體易變質，產生難聞臭味，故在原配方的基礎上加入甘油防止腐敗變質，產生臭味。

2.3.1 原配方

配方一[13-15]：淀粉0.01 g/mL、乳糖0.09 g/mL、糊精0.01 g/mL、氯化鈣1.5 mg/mL、氯化鈉0.1 mg/mL。

配方二[14-15]：硝酸鉀0.1 mg/mL、甘油0.05 g/mL、D-山梨醇0.05 g/mL、葡糖糖0.05 g/mL、海藻糖0.05 g/mL。

2.3.2 改進配方

配方一：淀粉0.01 g/mL、乳糖0.09 g/mL、糊精0.01 g/mL、氯化鈣1.5 mg/mL、氯化鈉0.1 mg/mL、甘油0.025 g/L。

配方二：硝酸鉀0.1 mg/mL、甘油0.075 g/mL、D-山梨醇0.05 g/mL、葡糖糖0.05 g/mL、海藻糖0.05 g/mL。

圖2 加入穩定劑配方酶活力的保存率

劉晶晶[13]和聶國興等[14]研究表明，添加穩定助劑或者無機離子成分在一定含量范圍內可以激活胰淀粉酶活力，認為穩定劑配方內含有這些物質，所以胰淀粉酶活力增高。加入穩定劑配方后，在溫度35 ℃條件下，隨著時間加長，配方一保存24 h，胰淀粉酶酶活力升高，但保存48 h后胰淀粉酶酶活力保存率為99.60%，保存144 h后，胰淀粉酶酶活力保存率1%，近失活狀態。配方二和配方一相同，保存24 h胰淀粉酶酶活力升高，但超過24 h后，配方二胰淀粉酶酶活力開始下降，保存144 h，胰淀粉酶酶活力仍保存89.70%的酶活。

由圖3可知，隨著溫度上升胰淀粉酶保存的酶活力下降越快，25與35 ℃相比，保存時間168 h時，25℃胰淀粉酶酶活力的存活率為90.08%，而35 ℃則下降到78.30%。下降速度，30與35 ℃胰淀粉酶酶活力的下降速度相近，但30，35和25 ℃相比，25 ℃時胰淀粉酶酶活力下降速度緩慢較明顯。所以溫度越低胰淀粉酶的酶活力保存時間越長，且胰淀粉酶酶活力下降速度越慢。

圖3 配方二不同溫度下保存酶活的保存率

3 結論

通過對豬胰臟中胰淀粉酶的提取的單因素及其穩定性的研究，確定對胰淀粉酶活力最大的因素是提取劑，其次是提取pH，影響最小的是提取溫度。確定最佳工藝為：原料采用冷凍豬胰臟，提取劑采用磷酸鹽緩沖液，提取pH 6.8，提取時間2 h，提取溫度30 ℃，用透析袋方法對粗酶進行反滲透濃縮，酶活力比粗酶的酶活力高5.2倍。加入穩定劑配方為：硝酸鉀0.1 mg/mL、甘油0.075 g/mL、D-山梨醇0.05 g/mL、葡糖糖0.05 g/mL、海藻糖0.05 g/mL。在35 ℃條件下，胰淀粉酶能保存近1周，保存率89.7%。胰淀粉酶保存溫度越低胰淀粉酶的酶活力保存時間越長，且胰淀粉酶酶活力下降速度越慢。此方法簡單易操作，時間短，成本低，環保、易于產業化生產。在酶穩定性保存中有些物質利于酶活增高，可以考慮在提取過程中加入，此方法有待研究。