響應面法優化高脂酸奶發酵工藝及其品質分析

朱靜靜，張紅彩，趙存朝，黃艾祥，王雪峰，2*，陳越

1. 云南農業大學食品科學技術學院（昆明 650201）；2. 云南省畜產品加工工程技術研究中心（昆明 650201）；3. 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所（昆明 650223）

發酵乳制品以其特有的營養及保健功能深受大眾喜愛，含有人體需要的各種營養成分，比鮮奶更容易吸收[1]。近些年，低脂酸奶熱度漸減，而享受型全脂酸奶正在回歸，具有醇厚口感、飽腹感的全脂酸奶更是受到廣大消費者的青睞。高脂酸奶是以生鮮牛乳為原料，奶油和乳清蛋白粉等為輔料，經乳酸菌發酵而成。其中，乳清蛋白粉的加入可提高蛋白質含量，改善其風味和質地，以及減少乳清析出而延長保質期[2-4]；奶油的添加還可以改善高脂酸奶的感官品質，快速補充能量，增加飽腹感[5-6]。該產品可直接食用或涂于面包、蛋糕和焙烤類食物上食用，有望成為酸性奶油的替代品。

試驗在不影響奶油口感和營養品質的前提下，將奶油添加到鮮牛乳中，與乳清蛋白粉、蔗糖等輔料互配進行發酵，經過特定的發酵工藝制成高脂酸奶。以感官評分值為主要評價指標，通過單因素試驗和響應面試驗優化高脂酸奶的最佳發酵工藝條件，并對其進行品質分析，為后續該產品的生產應用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 試驗材料

生鮮牛乳、淡奶油、白砂糖、三花調制乳、乳清蛋白粉（WPC35），均為市售。

1.1.2 菌株與培養基

CICC 6063嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、CICC 6064瑞士乳桿菌（Bulgaria lactobacillus），購自中國工業微生物菌種保藏中心；MRS培養基、MRS肉湯，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 儀器與設備

SVJ-358型智能型酸奶機，北京世紀陽光有限公司；STARER 3100型pH計，奧豪斯儀器有限公司；JJ-05725型均質機，廊坊通用機械制造公司；SGK-2 LB型低噪音空氣泵，北京東方精華苑科技有限公司；XS-402型脂肪測定儀，南京光學有限公司；KDY-9810型凱氏定氮儀，北京電子技術有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 發酵菌種活化及配比

分別取適量乳桿菌菌株凍干粉進行3次活化得到菌懸液，將活化后的乳酸菌接種到原料乳中馴化增殖，依次調整菌種接種量為3%（0.3×106CFU/mL）、4%（0.4×106CFU/mL）、5%（0.5×106CFU/mL），37℃恒溫培養至凝乳，反復傳代，以達到試驗要求，保證菌種活力能在4 h內凝乳。選取活性最強的嗜熱鏈球菌和瑞士乳桿菌以4%的接種量按（1∶1，1∶2，1∶3，2∶1和3∶1）5種配比進行復配，以感官評分為指標，確定高脂酸奶發酵菌種的最佳配比。

1.2.2 高脂酸奶發酵工藝流程

鮮牛乳→添加配料→攪拌混勻→65 ℃預熱→二次均質（5～8 MPa、9～10 MPa各均質一次）→85 ℃殺菌30 min→冷卻至40～45 ℃→接種乳酸菌發酵劑→灌裝→30 ℃條件下恒溫發酵35 h→放入2～4 ℃冰箱冷藏24 h

1.2.3 感官評分

參照GB/T 15691—2008[7]，隨機抽取20瓶樣品，在自然光線下，用肉眼觀其色澤，聞其香味，并取少許放入舌尖，涂布滿口，品嘗其滋味，具體感官評分標準見表1。

表1 高脂酸奶感官評分標準

1.2.4 發酵工藝優化單因素試驗

以感官評價為評分指標，分別考察發酵溫度（25，30，35，40和45 ℃）、乳清蛋白粉添加量（質量分數為1.2%，1.4%，1.6%，1.8%和2.0%）、發酵劑添加量（質量分數為1%，2%，3%，4%和5%）、奶油與生鮮牛乳體積比（1∶0.5，1∶1，1∶1.5，1∶2和1∶2.5）、蔗糖添加量（質量分數為10%，12%，14%，16%和18%）、發酵時間（20，25，30，35和40 h）、后熟時間（12，24，36，48和60 h）7個因素對高脂酸奶感官品質產生的影響。

1.2.5 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，利用Box-Behnken試驗設計，選取奶油與鮮牛乳的體積比（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）、后熟時間（D）4個因素，以感官評分值為響應值，通過響應面分析方法優化高脂酸奶的制備工藝，分析水平見表2。

1.2.6 高脂酸奶的理化指標、乳酸菌活菌數測定

1.2.6.1 pH

采用防水型pH微測試筆。

1.2.6.2 酸度

參照GB 5413.34—2016[8]。

1.2.6.3 持水力

參照盧孝潔等[9]的方法。

1.2.6.4 蛋白質

參照GB 5009.5—2016[10]。

1.2.6.5 脂肪

參照GB 5009.6—2016[11]。

1.2.6.6 乳酸菌活菌數

參照GB/T 1634—1996[12]。

1.2.7 高脂酸奶的氨基酸測定

1.2.7.1 樣品處理及其衍生

參照王逍君等[13]的方法并進行修改。準確稱取2 g酸奶，置于20～30 mL安瓿瓶中，加入10 mL含0.1%苯酚的6 mol/L鹽酸，振搖使酸奶溶解或使酸奶均勻分散于溶液中，將安瓿瓶置于-20 ℃冰箱中冷凍3～5 min，充氮后用噴燈熔封，然后置于110 ℃左右的烘箱中水解24 h，取出冷卻，取水解液1 mL，置于濃縮儀中濃縮至干（或用氮氣吹干去除鹽酸），加入1 mL的0.1 mol/L稀HCl溶解，再用0.45 μm濾膜過濾。

參照王雪峰等[14]的方法并進行修改。準確量取氨基酸標準溶液及樣品水解液200 μL，分別置于1.5 mL離心管中，往每個離心管中準確加入正亮氨酸內標溶液20 μL，每個離心管中分別加入三乙胺乙腈溶液100 μL、異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混勻，室溫放置1 h，然后加入正己烷400 μL至各離心管，振搖后放置10 min，取下層溶液（PTC-AA），用0.45 μm針式濾器過濾，取濾液200 μL，加800 μL水稀釋，搖勻，待測。

1.2.7.2 樣品測定

色譜條件：Venusil AA氨基酸分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；進樣量10 μL；波長254 nm；流速1.0 mL/min。流動相A：稱取15.2 g無水乙酸鈉，加水1 850 mL，溶解后用冰醋酸調pH至6.5，然后加乙腈140 mL，混勻，用0.45 μm濾膜過濾。流動相B：80%乙腈溶液。

洗脫梯度如表3所示。

表3 流動相洗脫梯度

1.2.7.3 結果計算

根據標準物質的保留時間定性，內標法定量。

式中：f1為樣品溶液中各氨基酸峰面積/內標峰面積；f2為混合氨基酸標準溶液中各氨基酸峰面積/內標峰面；C為氨基酸對照品，μ g/mL。

式中：V為樣品溶液的定容體積，mL；W為樣品質量，g。

1.2.8 高脂酸奶產香能力的測定

參照李婭等[15]方法測定后熟24 h、pH 3.32的高脂發酵乳中的乙醛、丁二酮含量，評價其產香能力。

1.2.9 數據處理

每個樣品至少3次重復數據，以平均值（AV）±標準差（SD）表示。通過SPSS 17.0軟件對數據進行方差顯著性分析，p＜0.05時表示差異顯著。最小顯著差異法用于數據多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 高脂酸奶發酵菌種的確定

由圖1可知，嗜熱鏈球菌和瑞士乳桿菌比例為1∶2時感官評分值最高；嗜熱鏈球菌在發酵過程中主要產生乳酸和葉酸，增加酸奶黏度，可縮短酸奶凝乳時間，而瑞士乳桿菌則產生大量乳酸和特殊香味物質[16]。因此，選取嗜熱鏈球菌與瑞士乳桿菌比例1∶2為最佳的發酵菌種復配比例。

圖1 菌種發酵劑比例對高脂酸奶感官品質的影響

2.2 高脂酸奶發酵工藝單因素試驗

2.2.1 奶油與生鮮牛乳體積比對高脂酸奶感官品質的影響

由圖2可得知，隨著奶油與生鮮牛乳體積比的增加，高脂酸奶產品的感官評分值出現先升后降的趨勢。比例過高過低都會導致感官評分值降低，比例過低酸奶的凝固狀態和風味不足，比例過高則有大量脂肪上浮，影響產品狀態。因此，選取奶油與生鮮牛乳體積比1∶1.5為最佳比例。

圖2 奶油與生鮮牛乳體積比對高脂酸奶感官品質的影響

2.2.2 蔗糖、發酵劑、乳清蛋白粉添加量對高脂酸奶感官品質的影響

江岸區位于武漢市中心地帶，是武漢市委、市政府所在地，轄區面積70.25平方公里，戶籍人口71.11萬，常住人口100余萬，為居民日常生活供應蔬菜的農貿市場現有36家，蔬菜農藥殘留的多少直接決定了居民餐桌飲食安全與否。把握源頭是食品安全監管的關鍵，降低居民餐桌飲食風險，必須緊緊抓住蔬菜農殘檢測這個“牛鼻子”。

由表4可知，蔗糖添加量、發酵劑添加量、乳清蛋白粉添加量質量百分數分別為16%，3%和1.6%時感官品質達到最好。蔗糖可為人體增加能量、增加酸甜口感、縮短發酵時間，添加量過少會影響發酵效果，添加過多酸甜味不協調，嚴重影響口感[17]；發酵劑可為牛乳提供益生菌，但是過高會對人體產生一定的危害，過低則發酵不完全[18]；乳清蛋白粉的加入可提高酸奶蛋白質含量，提高營養價值，增強其持水性[4]。

表4 蔗糖、發酵劑、乳清蛋白粉添加量對高脂酸奶感官品質的影響

2.2.3 發酵溫度對高脂酸奶感官品質的影響

由圖3可知，高脂酸奶發酵過程中隨著溫度逐漸提高，感官評分呈先上升后下降的趨勢，30 ℃時的感官評分最高，可能是由于隨著發酵溫度的提高，使乳蛋白變性，使高脂酸奶產生怪味或異味，影響感官評分。

圖3 發酵溫度對高脂酸奶感官品質的影響

2.2.4 發酵時間對高脂酸奶品質的影響

由圖4可以看出，發酵時間達到35 h時感官評分值達到最高，之后逐漸下降。發酵時間過短時，乳蛋白的交互結構形成不充分，不能包裹乳中原有的水分使乳清大量析出[19]；發酵時間過長，酸奶凝乳較好，無乳清析出，但長時間發酵導致乳酸菌大量繁殖，菌種大量損耗，影響其風味[20]。

圖4 發酵時間對高脂酸奶感官品質的影響

2.2.5 后熟時間對高脂酸奶感官品質的影響

由圖5可知，隨著后熟時間的延長，感官評分呈先上升后下降的趨勢，后熟24 h的感官評分最高，可能由于隨著發酵乳后熟過程中時間的延長，高脂發酵乳中的風味物質被損耗或轉化為其他物質，導致感官品質受到影響。

2.3 響應面法優化

2.3.1 響應面試驗設計及結果

根據單因素試驗結果，建立Box-Behnken Design中心組合設計試驗模型，通過擬合二次方程計算最優工藝組合。選擇奶油與生鮮牛乳體積比（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）、后熟時間（D）四因素三水平響應平面試驗，試驗結果見表5。

圖5 后熟時間對高脂酸奶感官品質的影響

表5 響應面分析方案及結果

利用軟件對表6進行多元回歸擬合，得到高脂發酵乳感官評分對奶油與生鮮牛乳體積比（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）、后熟時間（D）的二次方程模型為：Y=61.33+5.52A-0.53B-3.87C-1.2D-6.13AB-1.47AC+1.8AD+1.47BC+1.16BD-5.07CD+5.59A2+2.32B2-3.75C2+1.53D2。

回歸模型的方差分析結果見表6。

表6方差分析可知：回歸模型顯著性檢驗p=0.000 5＜0.01，說明二次多元回歸模型極顯著；感官評分回歸模型失擬性檢驗p=0.096 9＞0.05，可認為二次回歸模型與實際試驗擬合性充分模型失擬不顯著。CV表示試驗本身的精度，CV值越小，試驗的可靠性越高，試驗中CV比較低，為5.68%。

表6 感官評分回歸模型方差分析

綜上所述，回歸模型擬合程度良好，試驗誤差小，說明試驗操作可信度高，具有一定的實用性指導意義。各因素的F值越大，說明影響越顯著[21]，以上模型可看出各因素對高脂酸奶感官品質影響的順序為：（A）奶油與生鮮牛乳體積比＞（C）發酵時間＞（D）后熟時間＞（B）發酵溫度。

2.3.3 響應面優化分析

通過觀察圖6中響應面的變化情況和等高線的稀疏程度可直觀地反映奶油與生鮮牛乳體積比（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）、后熟時間（D）交互作用對高脂酸奶感官品質的影響，當響應面圖呈橢圓形或馬鞍形時，表示兩因素交互作用顯著[22]。

圖6和圖7為有二次回歸方程擬合得到的響應值Y的等高線及三維曲面圖，是回歸方程的形象描述。由等高線圖可知，A與B，C與D之間成馬蹄形，說明交互作用顯著（p＜0.05）。奶油與生鮮牛乳體積比響應面坡度較發酵溫度的陡峭，說明其對高脂酸奶感官品質的影響比發酵溫度大；發酵時間坡度比后熟時間的陡峭，說明發酵時間對高脂酸奶感官品質的影響比后熟時間大。結果與方差分析結果一致。

圖6 奶油與生鮮牛乳體積比（A）、發酵溫度（B）對感官評分的影響

圖7 發酵時間（C）、后熟時間（D）時間對感官評分的影響

2.3.4 最佳條件的確定和回歸模型的驗證

由表7可知回歸模型通過響應面法得到高脂發酵乳工藝條件為高脂酸奶的最佳發酵工藝為：奶油與生鮮牛乳體積比1∶1.5、糖的添加量16.4%、乳清蛋白粉添加量1.6%、發酵劑的添加量3%、發酵溫度30℃、發酵時間35 h、后熟時間24 h。此時感官評分值為88.15?？紤]實際操作情況與設備參數狀況，將糖的添加量調整為16%，在上述最佳條件下進行驗證試驗，得到高脂發酵乳感官評分平均值為87.12，與理論值接近，說明該回歸模型得到的優化參數準確性高。

表7 最佳條件的確定和回歸模型的驗證

2.3.5 高脂酸奶的理化指標、乳酸菌活菌數測定

在最優發酵工藝條件下，測定高脂酸奶產品的的理化指標、乳酸菌活菌數，見表8。

由表8可知，此工藝條件下得到的高脂酸奶產品質量符合發酵乳的食品安全國家標準。其中，蛋白質含量是普通酸奶含量的2倍，脂肪含量幾乎是普通酸奶的4倍（普通酸奶脂肪含量在3.0 g/100 g左右）。因此，該產品可作為酸性奶油的替代品，且風味優于普通酸奶。

表8 高脂酸奶的理化指標、乳酸菌數測定

2.3.6 高脂酸奶中氨基酸種類及含量分析

圖8 17種氨基酸標準品色譜圖

圖9 普通酸奶樣品氨基酸色譜圖

圖10 高脂酸奶樣品氨基酸色譜圖

表9 普通酸奶與高脂酸奶樣品中氨基酸含量比較

由表9可以看出，普通酸奶（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌為發酵菌種，鮮牛乳為原料，白糖添加量8%、發酵溫度43 ℃、發酵時間8 h）與高脂酸奶的氨基酸種類及含量存在較大差異，高脂酸奶氨基酸組成中精氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸含量明顯高于普通酸奶，但氨基酸總量（0.021 0%）要低于普通酸奶氨基酸總量（0.039 4%），主要是由于高脂酸奶加工原料中鮮牛乳含量小于普通酸奶，經過低溫長時發酵，氨基酸損耗較大，氨基酸可能被消耗或者轉化為其他物質[23]。

2.3.7 高脂酸奶產香能力的測定

乙醛和丁二酮是構成發酵乳風味的主要成分，賦予發酵乳特殊的香味[15]。高脂酸奶在后熟24 h階段，測得其乙醛、丁二酮含量較高，分別為60.06和34.68 mg/L，是賦予該產品特殊酪香味的主要原因。

3 結論

試驗通過單因素試驗和響應面試驗，確定了高脂酸奶的最佳發酵工藝條件為：菌嗜熱鏈球菌與瑞士乳桿菌按1∶2的菌株比例復配、4%的接種量，奶油與生鮮牛乳體積比1∶1.5、糖的添加量16%、乳清蛋白粉添加量1.6%、發酵劑添加量3%、發酵溫度30 ℃、發酵時間35 h、后熟時間24 h。此條件下所得產品凝固性好、口感爽滑、酸甜適中、飽腹感足、具有特殊的酪香味，產品中蛋白質含量4.24 g/100 g、脂肪含量12.26 g/100 g、滴定酸度90.7 °T、乳酸菌活菌數達1.86×106CFU/mL、乙醛與丁二酮含量分別為60.06和34.68 mg/L。所得產品成本低于現售淡奶油產品，有望成為酸性奶油的替代品。