蘆筍下腳料可溶性纖維的提取及其抗氧化性

王瑤 ，吳茂玉，王兆升，張明，楊立風，馬超*

1. 中華全國供銷合作總社濟南果品研究院（濟南 250014）；2. 山東農業大學食品科學與工程學院（泰安 271000）

蘆筍（Asparagus officinalis Linn.）又名石刁柏，為百合科天門冬屬植物。蘆筍含有多種游離氨基酸、維生素、微量元素等營養成分，以及皂苷、黃酮等藥用成分，具有較高的食用和藥用價值[1]。蘆筍下腳料為蘆筍速凍產品或罐頭產品加工后所剩下的老莖等部分，約占鮮樣的40%[2]。廢棄物中含有豐富的活性物質膳食纖維，并具有降低過氧化脂質、膽固醇，提高超氧化物歧化酶活性和免疫器官質量的作用，能明顯地延緩衰老和提高免疫，是值得研究和開發利用的可貴資源。

關于蘆筍可溶性膳食纖維（SDF）的研究主要集中在鮮食部分的抗衰老、抗腫瘤、增強免疫力等方面[3]。有關蘆筍下腳料可溶性膳食纖維的提取及抗氧化功能的未見系統研究。在實際生產中大部分被丟棄，不僅造成資源浪費，而且有礙環境友好型產業建設。試驗以綠蘆筍加工下腳料為原料，采用響應面試驗來確定蘆筍可溶性膳食纖維超聲輔助酶法提取的最佳工藝，并對其抗氧化活性進行系統研究，以期為蘆筍下腳料功能食品及藥品的開發提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料與試劑

蘆筍下腳料；淀粉酶（800 U/mL）、蛋白酶（2 500 U/mL）（均為Solarbio公司）；乙醇；水楊酸；FeSO4；雙氧水；DPPH標準品；鐵氰化鉀；三氯乙酸；FeCl3；FeCl2；磷酸氫二鈉；磷酸二氫鈉；菲啰嗪等。

1.2 儀器與設備

RHP-250A型高速多功能粉碎機（浙江永康市榮浩工貿有限公司）；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵（鄭州長城工貿有限公司）；TDL-5-A離心機（上海安亭科學儀器廠）；KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；PHS-3 C pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；ME104電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；SHA-B雙功能水浴恒溫振蕩器（江蘇杰瑞爾電器有限公司）；UV 1000紫外可見分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘆筍下腳料可溶性膳食纖維提取工藝

蘆筍下腳料→洗凈、烘干→粉碎→酶解和超聲提取→抽濾→醇沉→離心→干燥、稱質量→蘆筍SDF

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 酶添加量

稱取蘆筍加工下腳料3.00 g，加入60 mL蒸餾水，調pH 5.5～7.0，分別加入0.5，0.6，0.7，0.8和0.9 mL淀粉酶，混勻，90 ℃水浴振蕩1 h，冷卻。加入0.4 mL蛋白酶，混勻，45 ℃振蕩水浴1 h，冷卻。抽濾，濃縮，加入4倍體積的無水乙醇，靜置過夜，離心（4 000 r/min，5 min），沉淀物烘干后即為可溶性膳食纖維，稱質量，并計算得率。討論不同淀粉酶用量對蘆筍SDF得率的影響[8]。

稱取蘆筍加工下腳料3.00 g，加入60 mL蒸餾水，調pH 5.5～7.0，0.7 mL淀粉酶，混勻，90 ℃水浴振蕩1 h，冷卻。分別加入0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL蛋白酶，混勻，45 ℃振蕩水浴1 h，冷卻。抽濾，濃縮，加入4倍體積的無水乙醇，靜置過夜，離心（4 000 r/min，5 min），沉淀物烘干后即為可溶性膳食纖維，稱質量，并計算得率。討論不同蛋白酶用量對蘆筍SDF得率的影響。

1.3.2.2 超聲位置

稱取蘆筍加工下腳料3.00 g，加入60 mL蒸餾水，調pH 5.5～7.5，加入0.7 mL淀粉酶，混勻，90 ℃水浴振蕩1 h，冷卻。加入0.6 mL蛋白酶，混勻，45 ℃振蕩水浴1 h，冷卻。分別在加淀粉酶之前、淀粉酶酶解過程中、加蛋白酶之前、蛋白酶酶解過程中、蛋白酶酶解后五個位置進行超聲處理20 min。抽濾，濃縮，加入4倍體積的無水乙醇，靜置過夜，離心（4 000 r/min，5 min），沉淀物烘干后測得可溶性膳食纖維得率。研究不同超聲位置對綠蘆筍加工下腳料可溶性膳食纖維得率的影響。

1.3.2.3 超聲時間

稱取蘆筍加工下腳料3.00 g，加入60 mL蒸餾水，分別進行超聲處理5，10，20，30和40 min。調pH 5.5～7.5，加入0.7 mL淀粉酶，混勻，90 ℃水浴振蕩1 h，冷卻。加入0.6 mL蛋白酶，混勻，45 ℃振蕩水浴1 h，冷卻。抽濾，濃縮，加入4倍體積的無水乙醇，靜置過夜，離心（4 000 r/min，5 min），沉淀物烘干后測得多糖得率。研究不同超聲時間對綠蘆筍加工下腳料可溶性膳食纖維得率的影響。

1.3.3 響應面設計方案

根據單因素試驗結果，選擇淀粉酶添加量、蛋白酶添加量、超聲時間4個對蘆筍SDF提取率影響顯著的因素為響應變量，SDF得率為響應變量，進行響應面優化試驗。采用Design-Expert 8.0統計軟件，進行Box-Behnken試驗方案，設計四因素三水平二次回歸方程，擬合各因素和SDF得率之間的函數關系。試驗因素水平見表1。

表1 Box-Behnken響應面設計試驗因子與水平表

1.3.4 蘆筍下腳料SDF的抗氧化性分析

將提取的SDF進行復溶，按照Sevage法（V提取液∶V氯仿∶V正丁醇=100∶20∶4）進行脫蛋白處理。

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力測定

取0.5 mL樣品溶液與2.5 mL 6×10-5mol/L的DPPH溶液充分混勻，避光靜置30 min，于515 nm處測吸光度A1。同理測定2 mL樣品溶液與2 mL無水乙醇充分混勻后的吸光度A2，2 mL蒸餾水與2 mL DPPH溶液充分混勻后的吸光度A0[4]。同時以相同條件下直接水提的SDF溶液作對照。

1.3.4.2 還原力的測定

分別取不同濃度的樣品提取液1 mL，加入0.2 mL的0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液62.5 mL+0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液37.5 mL）和0.5 mL 1%的K3[Fe(CN)6]溶液。混勻后50 ℃反應20 min，冷卻。加入1 mL 10%三氯乙酸溶液、0.2 mL 0.1%FeCl3溶液和3 mL的蒸餾水混勻，靜置5 min，用無水乙醇代替樣品溶液做空白對照，700 nm處測吸光度A[5-6]。

1.3.4.3 羥自由基（·OH）清除能力測定

分別取0.2 mL不同濃度的樣品溶液，依次加入1 mL 0.15 mmol/L的FeSO4溶液，0.4 mL 2 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，1 mL 6 mmol/L的H2O2溶液。混勻后靜置1 h，于510 nm處測吸光度A1。同時用蒸餾水代替樣品溶液測得吸光度A0，用蒸餾水代替水楊酸溶液測得吸光度A[5]2。

1.4 數據分析

利用SPSS 18.0和Design-Expert 8.0數據處理軟件進行數據處理及統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 淀粉酶添加量對蘆筍下腳料可溶性膳食纖維得率的影響

由圖1可知，α-淀粉酶用量對可溶性膳食纖維的含量具有限制作用[8]，隨著α-淀粉酶用量增加，樣品中的淀粉逐漸去除，被淀粉纏繞的可溶性膳食纖維逐漸被釋放出來。α-淀粉酶用量超過0.7 mL時，SDF得率不再有明顯變化。α-淀粉酶用量超過0.7 mL時，可溶性膳食纖維含量不再升高，說明此時的α-淀粉添加量對于樣品達到飽和。

圖1 淀粉酶添加量對綠蘆筍下腳料中可溶性膳食纖維得率的影響

2.1.2 蛋白酶添加量對蘆筍下腳料可溶性膳食纖維得率的影響

由圖2可以看出，隨著蛋白酶加入量增加，蘆筍可溶性膳食纖維的提取率先呈上升后下降趨勢，酶加入量0.6 mL時，提取率升至最高值。可能是因為酶濃度過低時，催化能力不夠，降解出的可溶性膳食纖維量較低；而酶用量過高時，可能是因為可溶性膳食纖維中的某些糖苷鍵會被過量的酶分解，從而導致蘆筍可溶性膳食纖維的得率下降[9]。

圖2 蛋白酶添加量對綠蘆筍下腳料中可溶性膳食纖維得率的影響

2.1.3 不同超聲位置對蘆筍下腳料可溶性膳食纖維得率的影響

根據前面單因素結果，選用淀粉酶和蛋白酶繼續進行不同超聲位置對可溶性膳食纖維得率的研究，由圖3可以看出，得率由高到低依次是淀粉酶前、蛋白酶后、淀粉酶酶解中、淀粉酶后蛋白酶前、蛋白酶酶解中，在加淀粉酶處理之前進行超聲處理效果最好，可溶性膳食纖維得率為7.84%。

2.1.4 超聲時間對蘆筍下腳料可溶性膳食纖維得率的影響

隨著時間增加，可溶性膳食纖維得率逐漸增大，20 min時，可溶性膳食纖維得率最大，隨后逐漸減低。可能是因為時間延長，超聲引起的熱量積聚或機械剪切作用導致可溶性膳食纖維的結構變化而損失[10]；提取時間過長，會導致可溶性膳食纖維分解，雜質溶出。

圖3 超聲位置對可溶性膳食纖維得率的影響

圖4 超聲時間對可溶性膳食纖維得率的影響

2.2 響應面優化蘆筍下腳料可溶性膳食纖維提取工藝

2.2.1 回歸模型建立及顯著性檢驗

通過響應面試驗設計優化可溶性膳食纖維的提取工藝，試驗結果見表2。對此進行響應面分析，利用設計專家（Design-Expert 8.0）軟件對試驗結果進行二次多項式回歸擬合，得到可溶性膳食纖維得率的回歸方程模型為：SDF=8.21-0.29A-0.11B+0.25C+0.072AB-0.083AC-0.16BC-0.82A2-0.36B2-0.31C2。

所得回歸模擬方程的方差分析如表3。結果表明，模型的方差分析結果為p＜0.01，表明該回歸方程模型極顯著，且模型失擬項p=0.331 9＞0.05不顯著，復相關系數R2=0.971 3，校正系數R2adj=0.934 5，說明模型擬合程度較好，試驗誤差較小。

根據表3的結果可知，超聲時間對可溶性膳食纖維得率的影響顯著，且3個因素的二次項（X12、X22、X32）均有及顯著影響；各因素對響應值的排序由大到小依次為：超聲時間（X1）、淀粉酶添加量（X3）、蛋白酶添加量（X2）。通常兩兩因素交互作用的響應曲面圖可以直觀的反應兩因素交互作用對響應值的影響，即響應曲面越陡，各因素對響應值的影響越顯著，反之，各因素對響應值的影響較小[10]。從圖5（a）～（c）中可以看出兩兩因素交互作用與響應值的關系，交互作用對蘆筍可溶性膳食纖維的影響不顯著，這與表3中兩兩因素交互作用的p值均大于0.05相一致。但是圖5中的a、b曲面相對來說比較陡一些，說明超聲時間與蛋白酶添加量、超聲時間與淀粉酶添加量的交互作用對蘆筍下腳料可溶性膳食纖維得率有影響（可能與超聲時間影響顯著有關），但交互作用影響不顯著（p＞0.05）；c圖曲面相對較平緩，說明淀粉酶與蛋白酶添加量的交互作用對可溶性膳食纖維得率的影響很小。

表2 響應面分析試驗設計與結果

表3 回歸方程系數顯著性檢驗表

圖5 兩因素交互作用對可溶性膳食纖維得率影響的響應面圖

2.2.2 最佳條件的確定和回歸模型的驗證

通過前面響應面分析得到超聲輔助酶法提取蘆筍下腳料可溶性膳食纖維的最佳工藝條件為：超聲時間17.85 min、淀粉酶添加量0.75 mL、蛋白酶添加量0.54 mL。在此條件下理論得率為8.31%。在操作中對上述條件進行調整，確定的最佳工藝為：超聲時間18 min、淀粉酶添加量0.75 mL、蛋白酶添加量0.54 mL。在調整后的條件下，進行3次驗證試驗，得到蘆筍下腳料可溶性膳食纖維實際的提取率為8.20%，結果與理論預測較為接近。故而，該法優化得到的提取條件參數可靠。

2.3 蘆筍可溶性膳食纖維抗氧化性分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力測定結果

DPPH自由基是一種穩定的，在517 nm處有強吸收力的氮中心自由基，它可與自由基清除劑電子配對而使吸光度下降，下降程度與電子數量成正比，故被廣泛用于果蔬抗氧化活性的檢測[11]。

由圖6可知，隨著綠蘆筍加工下腳料可溶性膳食纖維和VC濃度增大，對DPPH·的清除率都呈逐漸上升趨勢，但1 mg/mL之后VC清除率逐漸平穩。多糖對DPPH·的清除能力低于VC，質量濃度為3 mg/mL時，可溶性膳食纖維對DPPH自由基的清除率達73.37%，VC清除率達93.20%。

2.3.2 還原能力測定結果

如圖7所示，綠蘆筍加工下腳料SDF還原能力與濃度呈線性相關。VC是一種極高效的還原劑，可溶性膳食纖維還原能力明顯弱于VC，但隨著濃度增大其還原力或可繼續提升。Li等[12]研究表明，還原力強弱主要受酮類存在影響，可通過釋放電子防止過氧化物的生成。由于高分子量的多糖也有供電子體，如羥基，亦可還原Fe3+，但多糖的具體還原機制仍有待研究。

圖6 不同方式提取的可溶性膳食纖維對DPPH自由基的清除作用

圖7 不同方式提取可溶性膳食纖維的還原力測定

2.3.3 羥自由基清除能力測定結果

羥自由基具有較強的氧化活性，可造成生物體的過氧化損傷，通常被認作是有害自由基[5]。羥自由基清除能力廣泛用于評價樣品抗氧化能力。由圖8可知，VC和綠蘆筍加工下腳料可溶性膳食纖維對羥自由基具有良好的清除作用，清除能力與濃度呈正相關，質量濃度為2 mg/mL時，羥自由基清除率97.46%，清除效果較好。

圖8 不同方式提取可溶性膳食纖維對羥自由基的清除作用

3 結論

在單因素試驗結果基礎上，利用響應面優化超聲輔助酶法提取蘆筍可溶性膳食纖維的工藝，并建立合理可靠的二次多項模型。確定的最佳工藝為：加酶前進行超聲處理18 min、淀粉酶添加量0.75 mL、蛋白酶添加量0.54 mL。在此條件下，蘆筍下腳料可溶性膳食纖維得率為8.20%。

綠蘆筍加工下腳料可溶性膳食纖維具有一定的抗氧化性能，對DPPH自由基清除能力隨著濃度增大而增強，在高濃度時或可與VC持平；對羥自由基清除能力較強，1.5 mg/mL時清除率可達90%以上；但相對還原力較低，不及VC還原力的1/4。