響應面優化飲料中咖啡因的前處理方法

魏陳楠，金惠玉*，陳彥鳳，趙嵐*

1. 黑龍江東方學院（哈爾濱 150066）；2. 黑龍江省疾病預防控制中心（哈爾濱 150036）

咖啡因是咖啡豆、茶葉等天然植物中常見的一種黃嘌呤類生物堿化合物，主要分布于植物的幼嫩組織部位，化學式C8H10N4O2，化學名稱1, 3, 7-三甲基黃嘌呤（137X）[1]。咖啡因具有興奮心臟、骨骼肌和中樞神經系統、抗氧化、舒張血管、松弛平滑肌等生理作用[2]，但大劑量或長期使用咖啡因會對人體中樞神經系統造成損害，引發心臟病和高血壓，且咖啡因具有成癮性，停用會出現渾身困乏疲軟、精神萎頓、頭痛、抑郁等各種戒斷癥狀，因此咖啡因又被列入國家管制的精神藥品范圍[3-5]。約80%的世界人口每天都在飲用含咖啡因的產品，其中最普遍的是咖啡（71%）、軟飲料（16%）和茶（12%）[6]。各國對飲料中的咖啡因都有相應標準。

飲料中咖啡因前處理技術有直接上機法、超聲提取、溶劑提取、氧化鎂法、超聲輔助提取等[7-11]方法，但都是針對不同種飲料，而利用Box-Behnken設計-響應面優化的前處理方法適用于所有飲料中的咖啡因前處理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

咖啡因標準品（純度大于99%，中國物質標準中心）；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（色譜純，中國DiKmapure公司）；純水（德國CNW公司）；氧化鎂（天津科密歐有限公司）。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（美國Waters e2695公司）；色譜柱C18（5 μm，200 mm×4.6 mm，Diamonsil）；手動單道移液槍（200 μL，1 mL和5 mL，美國RAININ公司）；漩渦振蕩器（REAX系列，德國Heidolph）；KQ-500VED型雙頻數超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；電子天平（CP324S德國Sartorius）；0.22 μ m、0.45 μm微孔濾水膜（中國Dikma公司）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的繪制

取0.9 mg（精確至0.1 mg）標準樣品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，則配制成90 μg/mL的標準儲備液，然后從儲備液中吸取0，25，50，100和200 μL的標定容到1 mL的進樣小瓶中，在上高效液相色譜（流速1.0 mL/min，流動相V甲醇∶V水=30∶70）中進行測定，標準曲線為Y=3.15×104X-1.57×105，R2=0.999 7。

1.3.2 樣品制備

取5 mL空白樣品（即不含咖啡因的飲料）定容于5 mL容量瓶中，并稱質量；加入300 μL的90 μg/mL咖啡因標準儲備液；將溶液用振蕩器混合均勻。得到5.4 μg/mL的樣品溶液。

1.3.3 樣品測定

將前處理之后的樣品，按1.3.1的高效液相色譜條件進行測定，得出相應測定值。

1.3.4 樣品回收率的計算

1.3.5 樣品前處理單因素試驗

1.3.5.1 超聲溫度對飲料中咖啡因的回收率的影響

按照1.3.2制備樣品，固定超聲時間20 min，氧化鎂加入0.2 g，選擇超聲溫度20，25，30，35和40 ℃。得到樣品靜置30 min，取清液，按照試驗方法1.3.3和1.3.4對飲料中前處理的樣品進行測定和回收率計算，每組試驗平行做6次。

1.3.5.2 超聲時間對飲料中咖啡因的回收率的影響

按照1.3.2制備樣品，固定超聲溫度40 ℃，氧化鎂加入0.2 g，選擇超聲時間0，10，20，30和40 min。得到樣品靜置30 min，取清液，按照試驗方法1.3.3和1.3.4對飲料中前處理的樣品進行測定和回收率計算，每組試驗平行做6次。

1.3.5.3 氧化鎂用量對飲料中咖啡因的回收率的影響

按照1.3.2制備樣品，固定超聲溫度40 ℃、超聲時間20 min，選擇氧化鎂用量0，0.2，0.5，0.8和1.1 g。得到樣品靜置30 min，取清液，按照試驗方法1.3.3和1.3.4對飲料中前處理的樣品進行測定和回收率計算，每組試驗平行做6次。

1.3.6 樣品前處理響應面試驗

根據單因素試驗的結果，利用Design-Expert的Box-Behnken試驗設計，選擇超聲溫度（A）、超聲時間（B）、氧化鎂質量（C）三因素三水平的響應面試驗（每組試驗平行做6次），考察因素及因素間交互作用對飲料中咖啡因回收率的影響，試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平表

1.3.7 樣品前處理試驗數據處理

用Expert整理數據，將單因素試驗得出的數據用Origin 85作曲線圖，用Design-Expert 8.0.6設計并分析飲料中咖啡因的最佳前處理條件。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理單因素試驗結果與分析

2.1.1 超聲溫度對飲料中咖啡因的回收率的影響

從圖1可以看出，超聲溫度在20～35 ℃時，隨著超聲溫度增加，咖啡因回收率逐漸增大，咖啡因回收率最大達94.8%。超聲溫度繼續增加，咖啡因回收率開始有下降趨勢，可能是溫度過高使得咖啡因結構遭到破壞導致咖啡因回收率下降[12]。因此，超聲溫度最佳條件為35 ℃。

圖1 超聲溫度對飲料中咖啡因回收率的影響

2.1.2 超聲時間對飲料中咖啡因的回收率的影響

從圖2可以看出，超聲溫度在0～20 min時，隨著超聲時間增長，咖啡因回收率逐漸增大，咖啡因回收率最大達95.12%。超聲時間繼續增加，咖啡因回收率基本不再改變，所以超聲時間最佳條件為20 min。

圖2 超聲時間對飲料中咖啡因回收率的影響

2.1.3 氧化鎂用量對飲料中咖啡因的回收率的影響

從圖3可以看出，氧化鎂用量在0～0.2 g時，隨著氧化鎂用量增加，咖啡因回收率逐漸增大，咖啡因回收率最大達95.2%。氧化鎂用量繼續增加，咖啡因回收率開始降低，因此氧化鎂用量最佳條件為0.2 g。

圖3 氧化鎂用量對飲料中咖啡因回收率的影響

2.2 樣品前處理響應面試驗結果與分析

根據單因素試驗的結果，利用Design-Expert的Box-Behnken試驗設計，選擇超聲溫度（A）、超聲時間（B）、氧化鎂用量（C）三因素三水平的響應面試驗，共17組試驗，從而得到對飲料中咖啡因前處理的最佳條件，見表2。

表2 響應面試驗設計與結果

2.2.1 咖啡因回收率回歸模型的建立和方差分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表3所得數據進行響應面試驗分析，以咖啡因的回收率（Y）為響應值，對各因素超聲溫度（A）、超聲時間（B）、氧化鎂用量（C）為變量分別進行二元多次回歸方程分析，二元多次方程為：Y=95.70+5.70A-0.92B-1.53C-1.96AB+1.36AC-1.51BC-4.50A2-4.4B2-5.09C2。由表3回歸方程的方差分析結果可知，試驗模的F值為57.85，p＜0.000 1，該試驗模型已經達到極顯著水平，則說明該二項式方程與實際回收情況擬合關系很好，證明咖啡因的回收率與超聲溫度、超聲時間、氧化鎂質量關系良好；該二項式方程決定系數R2=0.986 7，說明飲料中咖啡因的回收率與預測值非常接近，擬合度高和該回歸模型可靠性高，同時校正后修復系數R2adj=0.969 7，說明有96.97%的響應值變化可以被模型接受。次變異系數C.V=1.23%，說明該回歸模型的置信度較高，試驗的可靠性和精確度較好；方程的失擬項F值為5.16，p=0.073 4＞0.05，表示該回歸模型的失擬度不顯著，表明影響飲料中咖啡因前處理時回收咖啡因的未知因素對試驗結果干擾較小，說明該回歸模型的預測值與試驗值能有較好的吻合度，所以可用模型來分析和預測飲料中咖啡因前處理之后咖啡因回收率的大小。

由表3可知p值大小，A對咖啡因回收率極具顯著性，B、C具有顯著性，A和B、A和C、B和C具有顯著性。由表3可知F值大小，3個因素對咖啡因回收率的影響顯著程度排序為A＞C＞B，并且各試驗因素交互作用對咖啡因回收率的影響強弱依次為AB＞BC＞AC。因此，該二元多次方程較好描述咖啡因回收率隨著各種因素的變化規律，具有良好的分析和預測指導性。

表3 咖啡因含量方差分析

2.2.2 咖啡因回收率響應面和等高線圖分析

根據二項式數學模型，應用Design-Expert 8.0.6軟件，繪制考察指標與影響較顯著的兩個自變量的三維響應面圖和二維等高線圖，可以直觀地反映各因素對效應值的影響，每個效應面對其中兩個因素進行分析，另外一個因素固定在零水平上。從試驗所得的三維響應面圖上可以看出它們在反應過程中的相互作用，如圖4所示。

由圖4三維響應面圖及二維等高線圖可直觀觀察各因素及各因素之間關系，等高線表現為橢圓形或效應面傾斜度陡峭，說明該因素對咖啡因回收率的影響越顯著，等高線越密集表明該因素對咖啡因回收率的影響效果越大；等高線表現為偏圓形或效應面傾斜度平滑，則說明該因素對咖啡因回收率的影響不顯著，等高線越稀疏表明該因素對咖啡因回收率的影響效果越小。各影響因素對咖啡因回收率的影響不是簡單的線性關系，各等高線呈橢圓形或圓形，效應面傾斜度較陡峭，表明兩試驗因素間的相互影響較為顯著。從二維等高線上看，在超聲溫度35 ℃、超聲時間20℃、氧化鎂用量0.2 g附近值時，對提高咖啡因回收率有重要影響。

結合三維響應面圖和二維等高線圖分析可知，各試驗因素的主次順序為A＞C＞B。

2.2.3 咖啡因回收率最佳條件的選取及驗證試驗

根據回歸模型，利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結果進行分析，見圖5得到飲料中咖啡因前處理的最優化條件為：超聲溫度38.43 ℃、超聲時間17.48 min、氧化鎂用量0.2 g，咖啡因回收率預測值為97.78%?？紤]到實際操作的可行性，將優化條件修正為：超聲溫度38 ℃、超聲時間18 min、氧化鎂用量0.2 g。根據預測得出的最優提取工藝條件，平行進行6次驗證試驗，咖啡因回收率分別為96.12%，97.03%，96.88%，96.52%，98.29%和96.90%，平均值為96.91%，即回收率為96.91%±0.75%，與預測值的相對誤差為-0.84%，表明所建立的數學模型具有準確的預測性，所選前處理條件具有較好重現性。

圖4 因素交互作用對咖啡因回收率的影響

圖5 數值優化法試驗結果

3 結論

優化前處理方法，基于單因素試驗，利用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken試驗設計法對飲料中咖啡因前處理因素進行設計和優化。結果表明，A和B、A和C、B和C這3種交互作用對咖啡因的回收率均有顯著性影響。利用響應面分析方法所建立的數學模型對前處理條件優化的結果為：超聲溫度38 ℃、超聲時間18 min、氧化鎂用量0.2 g。在此條件下得到咖啡因回收率為96.91%±0.75%，與預測值一致，從而確定飲料中咖啡因前處理的最佳條件。該前處理方法簡便，精確度高，可預測性好，適用于各類飲料，為進一步開發飲料中咖啡因的前處理方法提供科學依據和試驗基礎。