藍(lán)圓鲹多肽亞鐵螯合物制備及其抗氧化性

肖玉娟，傅奇，何少貴*，林慧霞，楊燊

1. 廈門華廈學(xué)院環(huán)境與公共健康學(xué)院（廈門 361024）；2. 集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（廈門 361021）

藍(lán)圓鲹又稱池魚、巴浪魚，是中國東南沿海重要經(jīng)濟(jì)魚類之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，藍(lán)圓鲹的年產(chǎn)量僅次于帶魚和鳀魚，為中國第三大海洋捕撈魚類[1]。

星雨將“石壓蛤蟆”“死蚯蚓”“大道曰返”講給李離聽，李離也笑得前仰后合，一邊又正色對星雨講：“顏老師的字雄秀獨(dú)出，一變古法，兼收漢魏晉宋以來風(fēng)流，我朝書法名家，沒有誰超過他的。字如其人，他格力天縱，神乎其神，難以預(yù)測！練百花拂穴手中的‘快雪時(shí)晴’‘鐘林毓秀’，都應(yīng)體會(huì)書圣的筆意！”星雨聽得半懂不懂，只是覺得顏師父的課雖然沒什么意思，但這些促狹師兄太有意思了……

鐵是人和動(dòng)物體所必需的微量元素之一，嚴(yán)重缺鐵時(shí)不僅發(fā)生貧血，也可引起體內(nèi)含鐵的酶類缺乏，導(dǎo)致細(xì)胞呼吸發(fā)生障礙，影響組織器官的功能[2]。越來越多的人認(rèn)為多肽亞鐵螯合鹽是人和動(dòng)物鐵吸收的主要機(jī)制[3-5]。此外，國外有研究表明多肽螯合物還具有自由基清除活性[6-8]，國內(nèi)近年來在多肽螯合產(chǎn)物方面進(jìn)行較多研究[9-13]，也發(fā)現(xiàn)其具有一定自由基清除作用。

亨斯邁紡織染化通過研發(fā)可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)品，得到較快發(fā)展，擴(kuò)大了在中國市場的份額。她以研發(fā)的新一代染料產(chǎn)品AVITERA SE為例解釋道，該產(chǎn)品不僅完全符合中國環(huán)保要求，還可以幫助下游企業(yè)大幅度降低水和能源的消耗。用這種染料染棉織物可讓染廠比傳統(tǒng)高溫或中溫染整方法減少50%耗水量、70%耗能量、20%用鹽量，節(jié)省50%時(shí)間，既降低了成本，減少了水電煤用量，又降低了排污，在市場上很受歡迎。

MS包含了一系列促進(jìn)心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素，而且多呈高水平、多重聚集狀態(tài)，從而使心腦血管疾病的發(fā)病率、患病率明顯增加［11-12］。MS組分與終點(diǎn)事件之間存在劑量反應(yīng)關(guān)系，組分?jǐn)?shù)越多，其心血管疾病危險(xiǎn)因素水平越高［13］，本研究結(jié)果也表明隨著MS包含組分?jǐn)?shù)量增多，冠心病和腦卒中事件的發(fā)病率及相對風(fēng)險(xiǎn)呈現(xiàn)增加趨勢。因此積極開展MS的防治干預(yù)，從降低組分?jǐn)?shù)量的角度開展健康宣教和健康管理對心腦血管疾病及死亡的防治具有重大意義。

2017年底，價(jià)值投資行情大盛，這使得某位著名投資人喊出了“茅臺(tái)是菩薩，它是來給大家送錢的”的瘋狂話語。誰知，在2018年1月份之后，市場畫風(fēng)一轉(zhuǎn)，在2月7日滬指的一根大陰K線殺下來之后，市場登時(shí)“目瞪口呆”。怎么說好的價(jià)值投資呢？說好的沖4000點(diǎn)行情呢？

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)圓鲹（市售）。

2.1.3 溫度對Fe2+螯合反應(yīng)的影響

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti-25型高速冷凍離心機(jī)（美國貝克曼有限公司）；可見分光光度計(jì)UV-5200（廈門億辰科技有限公司）；Five Easv 20型臺(tái)式酸度測定儀（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部份收集器（上海琪特分析儀器有限公司）。

三是在水事違法案件查處、涉水許可等多項(xiàng)工作中宣傳《太湖流域管理?xiàng)l例》等水法規(guī)，增強(qiáng)政府、部門、流域公眾的法律意識(shí)，促進(jìn)了流域各地的宣傳活動(dòng)。兩省一市地方普遍開展了行政機(jī)關(guān)工作人員，特別是領(lǐng)導(dǎo)干部學(xué)習(xí)《太湖流域管理?xiàng)l例》的活動(dòng)，很多地方領(lǐng)導(dǎo)干部通過理論中心組、政府常務(wù)會(huì)議、專題法制講座培訓(xùn)、自學(xué)等多種方式廣泛開展學(xué)習(xí)，在很大程度上增強(qiáng)了依法決策、依法辦事的自覺性，流域水利系統(tǒng)干部職工、基層地方政府、廣大領(lǐng)導(dǎo)干部依法行政、積極踐行《太湖流域管理?xiàng)l例》的觀念普遍增強(qiáng)。持續(xù)、廣泛、創(chuàng)新的宣傳與培訓(xùn)取得了明顯效果，流域依法治水管水的氛圍越來越濃厚。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

清水清洗新鮮原料，瀝干后絞碎，分裝后置于-18 ℃冰柜凍藏備用。

試驗(yàn)采用藍(lán)圓鲹為原料，利用木瓜蛋白酶將其水解，通過凝膠柱層析收集不同分子量的多肽，并與亞鐵離子螯合，研究螯合物對羥基自由基、超氧自由基和DPPH自由基清除活性。

1.3.2 酶解工藝流程

1.3.3 多肽亞鐵螯合物合成工藝

原料→解凍→加水混勻→調(diào)節(jié)pH→加酶→酶解→煮沸滅酶5 min→冷卻→離心（4 000 r/min，10 min）→上清液定容→氨基酸態(tài)氮測定

酶解液→調(diào)節(jié)pH→調(diào)節(jié)溫度→加入金屬鹽→攪拌→加過量95%乙醇溶液→離心（4 000 r/min，20 min）→測螯合率

1.3.4 分析方法

具體的處理時(shí)間，1月24日與1月30日至2月2日兩個(gè)時(shí)間段處理的花序，拉長花序的效果不一樣，處理后產(chǎn)生的副作用也不一樣。處理時(shí)間早，花序拉得長。1月24日花序長至7～10 cm （新梢 20～25 cm，5 片真葉完全展開），處理倍數(shù)為1∶60 000，花序處理后果穗長度適中，處理后產(chǎn)生的副作用也小。在2月2日處理的，花序處理時(shí)間相對晚，處理時(shí)采用1月24日的濃度，處理后的果穗比1月24日處理的重，但副作用也比較明顯，比如有的果穗上出現(xiàn)不脫落和發(fā)育不全的小果粒，花序拉得過長，果穗稀疏松散等。

3.蝦苗投放。投放前將筐浸在水中，讓蝦適應(yīng)池塘（稻田）水溫，可先投放一筐，看蝦苗入水后是否正常，然后將蝦投放在池塘（稻田）四周，注意不要將蝦苗全部投放在一個(gè)位置，蝦苗活動(dòng)范圍有限。

螯合率測定公式：

1.3.5 抗氧化測定

1.3.5.1 羥自由基（·OH）清除率的測定[15]

在試管中分別加入0.5 mL 10 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、0.5 mL酶解液、0.5 mL 10 mmol/L FeSO4溶液、3.5 mL蒸餾水，加入5 mL 100 mmol/L H2O2啟動(dòng)Fenton反應(yīng)，搖勻后于510 nm處測定吸光度A1；取0.5 mL蒸餾水代替10 mmol/L FeSO4，測定吸光度A2；取0.5 mL蒸餾水代替酶解液，測定吸光度A3。

2.2.1 化學(xué)藥劑 化學(xué)藥劑是控制果蔬采后病害的常見的手段之一，具有經(jīng)濟(jì)、殺菌效果好、見效快等特點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于果蔬的采后病害的控制。對于楊梅果實(shí)采后病害控制的化學(xué)藥劑的研究有很多，肖艷等[19]采用不同濃度的CaCl2和萘乙酸的混合物處理?xiàng)蠲饭麑?shí)，發(fā)現(xiàn)能夠顯著提高果實(shí)的硬度，減緩軟化，并降低采后發(fā)病率。水楊酸是一種內(nèi)源激素，可以降低果蔬采后呼吸作用，延緩組織衰老，并能誘導(dǎo)相關(guān)抗病性酶的上升，降低果蔬采后的發(fā)病率[20]。

選取pH 6，室溫，以時(shí)間為單因素進(jìn)行螯合反應(yīng)，結(jié)果如圖2所示。

氨基酸態(tài)氮含量測定，按照GB 5009.235—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行；酶活力的測定：采用Folin法；游離態(tài)鐵含量的測定：鄰二氮菲法[14]。

將鄰苯三酚溶于10 mmol/L HCl溶液配制濃度3 mmol/L的溶液，并用去離子水配制質(zhì)量濃度分別為10，20，30，40和50 mg/mL的酶解液。取100 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）4.5 mL于25 ℃水浴保溫20 min，取出后立即加樣品5 mL、蒸餾水3 mL及鄰苯三酚0.5 mL后迅速搖勻，恒溫下每隔30 s測1次A325值，反應(yīng)4.5 min后結(jié)束，得樣品V樣（即每分鐘光吸收的平均變化率），空白管中以10 mmol/L HCl代替鄰苯三酚溶液，4.5 min內(nèi)鄰苯三酚自氧化速率為V自。

1.3.5.3 DPPH自由基（DPPH·）清除率的測定[17]

用去離子水配制成質(zhì)量濃度分別為1，2，3，4和5 mg/mL的酶解液。以95%乙醇溶解DPPH配成濃度10 mmol/L的溶液。取樣品液2.0 mL與2.0 mL DPPH·溶液混合搖勻，室溫下閉光放置30 min后測定517 nm處的吸光度，記為OD樣?？瞻坠芤?5%乙醇代替樣品，測定吸光度，記為OD空。

1.3.6 螯合前后連續(xù)紫外波長掃描[18]

將不同分子量范圍的多肽與亞鐵螯合，在波長范圍190～600 nm進(jìn)行紫外掃描，根據(jù)物質(zhì)吸收峰數(shù)目、吸收峰波長及峰值判斷是否有新的物質(zhì)生成。

2 結(jié)果與分析

2.1 Fe2+與藍(lán)圓鲹多肽螯合條件的影響因素試驗(yàn)

2.1.1 pH對Fe2+螯合反應(yīng)的影響

pH條件是影響多肽螯合物形成的重要因素。H+和OH-會(huì)與金屬離子競爭供電子基團(tuán)，不利于螯合物的生成。因此在室溫，時(shí)間10 min，研究pH對螯合反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖1所示。

結(jié)果表明，pH對螯合反應(yīng)的影響較大，pH 6時(shí)，其螯合率最高為95.1%。

2.1.2 時(shí)間對Fe2+螯合反應(yīng)的影響

1.3.5.2 超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的測定[16]

隨著時(shí)間延長，亞鐵離子與多肽螯合率變化不大，在10 min時(shí)的螯合率最高為95.1%，30 min時(shí)的螯合率最低為92.5%，可以推斷螯合反應(yīng)為快速反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間影響不大，選用最適時(shí)間10 min。

圖2 時(shí)間對Fe2+螯合反應(yīng)的影響

木瓜蛋白酶（酶活力實(shí)測為60×104U/g，廣西南寧龐博生物工程有限公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，美國Sigma公司）；牛血清白蛋白（國藥集團(tuán)）；抑肽酶（上海富蔗化工）；葡聚糖凝膠Sephadex G-25（國藥集團(tuán)）；桿菌肽（廣東光華化學(xué)）；酪氨酸（國藥集團(tuán)）。

選取pH 6，時(shí)間10 min，以溫度為單因素進(jìn)行螯合反應(yīng)，結(jié)果如圖3所示。

利用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整合后計(jì)算每一個(gè)被試的D值、D1值、D2值、d’值、d1’值、d2’值；利用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行信度和效度檢驗(yàn)，探討GNAT內(nèi)隱測量的信效度；通過描述性統(tǒng)計(jì)分析，探究不同實(shí)驗(yàn)順序下GNAT是否存在順序效應(yīng)；通過相關(guān)樣本t檢驗(yàn)，探討內(nèi)隱自我反應(yīng)時(shí)和內(nèi)隱他人反應(yīng)時(shí)、內(nèi)隱自我敏感性和內(nèi)隱他人敏感性之間的差異；通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，探討人口學(xué)變量對大學(xué)生內(nèi)隱自殺意念的影響.

在25～45 ℃范圍內(nèi)，螯合率隨著溫度變化不明顯，25 ℃時(shí)螯合率最高為95.56%，45 ℃時(shí)螯合率最低為93.45%。因此，選擇最佳溫度25 ℃。

圖3 溫度對Fe2+螯合反應(yīng)的影響

2.2 多肽分子量分布

試驗(yàn)利用Sephadex G-25色譜柱分離藍(lán)圓鲹酶解液，分離條件為上樣體積3.6 mL，流速1 mL/min，分離結(jié)果見圖4。

從圖4可以看出藍(lán)圓鲹酶解液經(jīng)Sephadex G-25色譜柱分離后，可分為明顯的6個(gè)組分。利用牛血清白蛋白、酪氨酸、抑肽酶、桿菌肽為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行洗脫，計(jì)算6個(gè)組分的分子量，分子量范圍見表1。

2.1 一般情況 兩組研究對象的一般情況除TG、TC、LDL-C指標(biāo)相差較大且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P＜0.05），在性別、年齡、BMI等指標(biāo)方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

圖4 多肽洗脫曲線

表1 各組分分子量范圍

經(jīng)計(jì)算發(fā)現(xiàn)峰6分子量范圍過小，可能為雜峰。

2.3 抗氧化活性測定

將分離后的多肽與亞鐵離子螯合，按照1.3.5的方法進(jìn)行自由基清除試驗(yàn)。

由表2可以看出，藍(lán)圓鲹多肽亞鐵螯合物具有較強(qiáng)的自由基清除作用。多肽分子量范圍在1 570～4 100 Da時(shí)，螯合物對羥基自由基（·OH）、超氧自由基（O2-·）清除率最高為50.41%和40.35%；多肽分子量范圍在170～1 230 Da時(shí)，螯合物對DPPH·清除率最高為55.46%。

表2 多肽亞鐵離子螯合物抗氧化活性

2.4 紫外掃描波峰比較

將分子量范圍為1 570～4 100 Da和170～1 230 Da的2組多肽螯合前后在190～600 nm處進(jìn)行連續(xù)紫外波長掃描比較，結(jié)果如圖5（a）和（b）所示。

多肽與亞鐵離子螯合，在吸收峰波長和峰值上均有明顯變化，說明有新物質(zhì)生成，發(fā)生螯合反應(yīng)。

檢驗(yàn)復(fù)合混沌序列的隨機(jī)性能常用的是NIST測試[17],由確定系統(tǒng)和算法產(chǎn)生的序列,最主要的測試包括其頻數(shù)測試、游程測試、譜測試和近似熵測試[18]。按照NIST測試的要求,為保證測試結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性,每個(gè)被測序列的長度應(yīng)為103～107。因此,選取每個(gè)序列長度為106[19]。

圖5 多肽及其亞鐵離子螯合物紫外吸收光譜

3 結(jié)論

藍(lán)圓鲹多肽螯合亞鐵離子的最佳螯合條件為：pH 6，溫度25 ℃，時(shí)間10 min。此時(shí)螯合率為95.6%。采用葡聚糖凝膠Sephadex G-25對水解液進(jìn)行分離，可分離得到5個(gè)吸收峰，經(jīng)計(jì)算分子量范圍分別為100～115，29～78，5～23，1 570～4 100和170～1 230 Da；抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，藍(lán)圓鲹多肽亞鐵螯合物具有較強(qiáng)的清除自由基作用，多肽分子量范圍在1 570～4 100 Da時(shí)羥自由基和超氧自由基清除率最高分別為50.41%和40.35%，多肽分子量范圍在170～1 230 Da的DPPH自由基清除率最高為55.46%；通過紫外連續(xù)波長掃描可以看出，吸收峰波長和峰值有明顯變化，說明發(fā)生螯合反應(yīng)。