紫茄超氧化物歧化酶的提取及其活性測定

潘百明，蘇輝蘭，梁昌祥，覃曉婷

賀州學院（賀州 542899）

紫茄也稱茄子、茄，為茄科植物，營養成分豐富，如含有膽堿、蛋白質、鐵、維生素、鉀等多種成分；紫茄中含超氧化物歧化酶（SOD）。SOD是生物體內氧自由基的天然清除劑，具有廣泛的醫用價值，可作為藥品、食品及日化產品的添加劑。SOD產品對市場的需求量較大，試驗采用鄰苯三酚自氧化法[1]，從紫茄中提取SOD并測定其活性，為尋找更廉價易得的SOD產品提取原料提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮紫茄（市售）。

1.2 試驗設備與儀器

HB-J 303打漿機（中山市漢寶隆電器有限公司）；H-1850 R冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；JY99-IIDN超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；HH-S 2數顯恒溫水浴鍋（金壇市醫療儀器廠）；723 N紫外-可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 藥品與試劑

磷酸二氫鈉（天津市科密歐化學試劑有限公司）；磷酸氫二鈉（天津市科密歐化學試劑有限公司）；三羥甲基氨基甲烷（上海潤捷化學試劑有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（成都市科龍化工試劑廠）；焦性沒食子酸（國藥集團化學試劑有限公司）；三氯甲烷（西隴化工股份有限公司）；無水乙醇（廣東華光科技股份有限公司）；丙酮（西隴化工股份有限公司）；鹽酸（西隴化工股份有限公司）。試劑均為分析純。

1.4 試驗方法

1.4.1 SOD酶液的提取

1) SOD提取

稱取用蒸餾水清洗3遍紫茄40 g，放入打漿機中打碎，而后用紗布過濾殘渣，加入3倍體積pH 7.8、0.05 mol/L的磷酸緩沖液，放入超聲破碎儀中超聲15 min，使SOD溶解到緩沖液中，然后再放入冷凍離心機中常溫離心15 min，取上清液。

2) 除雜蛋白

將氯仿-乙醇混合溶劑加入上述上清液中，體積為上清液的0.25倍，攪拌15 min，以5 000 r/min冷凍離心機離心15 min，棄去沉淀，得到上清液為粗酶液。

3) SOD的沉淀分離

將粗酶液分為均等的5份，每份分別加入不同比例冷丙酮，粗酶液與冷丙酮的比例分別為1∶0.5（編號為①），1∶1.0（編號為②），1∶1.5（編號為③），1∶2.0（編號為④）和1∶2.5（編號為⑤）。均攪拌15 min，冷凍離心機離心15 min，離心轉速為5 000 r/min，棄去上清液得到SOD沉淀。將沉淀先加入2 mL磷酸緩沖液，充分溶解后再加入3 mL緩沖液混勻。以5 000 r/min冷凍離心機再離心15 min，得到的上清液即為SOD酶液。

1.4.2 酶活性的測定

1.4.2.1 鄰苯三酚自氧化速率的測定

取2支干凈試管，1支為空白對照管，另1支為測定管。在兩支試管中分別加入pH 5.2的0.1 mol/L tris-HCl緩沖液4.5 mL，再分別加入雙蒸餾水4.2 mL，混勻置25 ℃恒溫水浴中20 min。在空白管中加入0.3 mL的10 mmol/L HCl，測定管中加入0.3 mL的7 mmol/L鄰苯三酚，使反應總體積達到9 mL。加入瞬間開始計時，4 min后迅速加入終止試劑8 mol/L HCl 1滴，混勻倒入比色皿。以空白管調零，選擇波長420 nm紫外-可見分光光度計測定吸光度（A）。每30 s測量1次A，計算線性范圍內每分鐘的增量，得到每分鐘鄰苯三酚自氧化速率的吸光度A0。

1.4.2.2 SOD活性的測定

測定方法同1.4.2.1，測定管中加入0.1 mL的紫茄提取液①（②④④⑤），而雙蒸餾水的體積相應減少。記錄測定管加入酶液后每分鐘SOD的吸光度A1[2]。

式中：9為反應總體積，mL；0.1為吸取提取液量，mL；N為樣液稀釋倍數。

總之，知識來源于實踐。數學教學要盡可能地接近學生的現實生活，要盡量給學生提供合作的素材和機會。有效的課堂不僅有利于學生掌握知識，而且有助于學生提高能力。

試驗得出最佳測定tris-HCl緩沖液pH。

1.4.3 反應溫度對酶測定的影響

丙酮比例、tris-HCl緩沖液pH、反應時間控制為不變量，取反應溫度分別為25，39，53，67和81 ℃。鄰苯三酚自氧化速率的測定及酶活性的測定方法同1.4.2.1，試驗得出最佳反應溫度。

1.4.4 反應時間對酶測定的影響

丙酮比例、tris-HCl緩沖液pH、反應溫度控制為不變量，取反應時間分別為20，30，40，50和60 min。測定方法同1.4.2.1，結果求得最優反應時間。

1.4.5 正交試驗

為了確定各不同影響因素對紫茄提取測定SOD的最優工藝條件，根據單因素試驗結果，以OD值為考察指標，選取丙酮比例、tris-HCl緩沖液pH、反應時間、反應溫度為影響因素，各取3個水平，以L9(34)正交表設計試驗，具體影響因素見表1。鄰苯三酚自氧化速率的測定及酶活性測定方法同1.4.2.1。

表1 因素水平表

2 結果與分析

2.1 pH對SOD活性的測定結果

從圖1可以看到，在只改變tris-HCl緩沖液pH，其他測定因素不變條下，最佳tris-HCl緩沖液pH 8.2，過酸或過堿都對SOD的測定有一定抑制作用，過酸或過堿會對SOD的“咪唑橋”結構會發生不可逆轉變，導致酶活性喪失，原因是SOD中的Zn2+在酸性或堿性條件下極易脫落。SOD對pH的穩定性是由于金屬輔基的存在，一旦去除金屬離子，穩定性將大大降低。因此，測定SOD活性最佳的tris-HCl緩沖液pH為8.2。

圖1 pH對SOD活性的測定結果曲線圖

2.2 反應溫度對SOD活性的測定結果

從圖2可以看到，由于Cu/Zn-SOD存在“咪唑橋”結構，“咪唑橋”活性中心并非剛性的固定結構，而應該是一種柔韌靈活的結構，任何物理、化學因素都可以影響它；溫度25 ℃時，各不同丙酮比例的酶液所測得的OD值均為最大值，說明超氧化物歧化酶對熱敏感，溫度較高容易失活，導致SOD得率較少，活性較低；SOD活力的最適溫度在25～30 ℃，因此整個酶活力測定應在該條件下操作為佳。因此，測定SOD活性最佳的反應溫度為25 ℃。

圖2 反應溫度對SOD活性的測定結果曲線圖

2.3 反應時間對SOD活性的測定結果

從圖3可以看到，反應時間20 min時，各不同丙酮比例的酶液所測得的OD值均為最大值，曲線圖整體呈現先上升后下降趨勢，隨著處理時間延長，酶活力下降；40～50 min曲線下降較為平穩，雖然偶有上下波動，但幅度并不大，說明在此之間酶活性影響不大；試驗表明，SOD活性最佳反應時間為20 min。

2.4 不同丙酮比例對SOD的提取結果分析

從圖4可以看到，當反應時間、反應溫度、tris-HCl緩沖液pH一定，丙酮比例1∶2時，SOD中蛋白質的沉淀分離效果最好，有利于保護酶活性，所以測得的活性也最大，OD值為288.94 U/mL。低于此比例的蛋白質的沉淀分離效果較差，而高于此比例所測得活性大小差不多，但丙酮用量較多，不利于成本節約，所以測定SOD活性最佳丙酮比例為1∶2。

圖3 反應時間對SOD活性的測定結果曲線圖

圖4 不同丙酮比例對SOD的測定結果曲線圖

2.5 正交試驗結果

正交試驗方案及試驗結果見表2。由正交試驗結果和極差分析可知，影響SOD測定結果的因素的主要順序為：丙酮比例（A）＞tris-HCl緩沖液pH（B）＞反應溫度（D）＞反應時間（C）。丙酮比例和反應溫度對SOD的測定結果影響最大，所以必須選擇最適合的丙酮酶液比并控制溫度，各因素的最優組合為A2B2C2D2，即丙酮比例1∶2、tris-HCl緩沖液pH 8.2、反應時間20 min、反應溫度25 ℃，在此最優測定條件下，SOD活性大小為296.36 U/mL。

表2 試驗方案及試驗結果

3 結論與討論

采用鄰苯三酚自氧化法測定紫茄中超氧化物歧化酶的活性，該方法具有操作簡單且快速、試劑用量小等優點。通過對鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性的試驗條件進行初步探討，試驗結果表明，用鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性的最佳條件為：tris-HCl緩沖液pH 8.2，反應溫度25 ℃，反應時間20 min，丙酮比例1∶2。

從天然材料紫茄中提取SOD酶，材料成本相對廉價，材料供應充足，適合大規模工業化生產，對需求量日益增加的SOD市場具有很大的推廣價值。另外，它符合人們“崇尚自然，回歸自然”的心理需求，代表社會發展趨勢。