疊氮化鈉對熒光性晚期糖基化終末產物的影響

楊玉瑩，樸春紅，王玉華，劉俊梅，胡洋，唐玉芳

吉林農業大學食品科學與工程學院（長春 130118）

蛋白質非酶糖基化通常指在非酶促條件下，氨基酸或蛋白質的游離氨基與葡萄糖（Glucose）或果糖（Fructose）等還原糖，經縮合、重排、裂解、氧化修飾產生一系列穩定產物的反應，其終產物被稱為晚期糖基化終末產物（Advanced glycation end products，AGEs）[1-2]。高血糖糖尿病患者體內的AGEs大量蓄積會引發糖尿病并發癥，如糖尿病性腎病、周圍神經病變和心血管疾病等[3-6]。在食品加工中尤其是高溫和長時間反應下產生的AGEs，可以被人體吸收，引發阿爾茨海默病等多種疾病[7]，受到廣泛關注[8]。

AGEs的生成機制復雜，產物也不同，具有交聯性或熒光性特性，一旦形成就不可逆，在人體內以多種不同形式存在[9-11]。其反應歷程可分為3個階段[12-13]：初期階段、中期階段和末期階段。目前，很多帶熒光性的AGEs已經成為研究主流。還原糖-蛋白質體系形成的AGEs能反映體內糖基化反應水平，常用于AGEs相關研究中。最為常見的糖基化體系中的還原糖為葡萄糖或果糖，蛋白質為牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA），其反應溫度為接近人體體溫37 ℃，時間為一般為4～12周[14-15]。由于反應體系中含有較高濃度的糖和蛋白質，且反應時間較長，極易滋生細菌，因此培養時常加入疊氮化鈉（NaN3）達到抑菌的目的[16-17]。NaN3具有優良的防腐殺菌性能，但尚未有報道表明其在非酶糖基化反應進程中是否影響模擬體內真正的糖基化反應進程。微孔濾膜抽濾（Microaperture section filter，MSF）滅菌方式是最接近機體產生的AGEs的最優滅菌方法。體內AGEs的積累是一個長期而緩慢的過程，隨著反應時間的延長蛋白修飾程度增強，產生高度糖基化的AGEs[18]。試驗采用MSF和NaN3滅菌方式，研究了兩種糖基化體系即葡萄糖-牛血清白蛋白（AGE-G-BSA）和果糖-牛血清白蛋白（AGE-F-BSA）反應體系在1～6個月期間AGEs生成的情況以及AGEs特性的變化，為系統的研究AGEs提供可參考的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

葡萄糖、疊氮化鈉、L-賴氨酸、鄰苯二甲醛、β巰基乙醇，北京化工廠；D-果糖、牛血清白蛋白標準品≥96%、Fructose Assay Kit，美國Sigma試劑公司；彩虹245廣譜蛋白Maker，北京索萊寶科技有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA蛋白定量測定試劑盒，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；葡萄糖測定試劑盒，上海榮盛生物技術有限公司。所有試劑純度均為分析純。

1.2 試驗儀器

3K15離心機，美國Sigma公司；ZHWY-200 B恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；SYNERGYHT多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；FLUO star Omega全自動多功能酶標儀，德國BMG LABTECH；5800 MALDI-TOF/TOF基質輔助激光質譜儀，美國AB SCIEX；Mini-PROTEAN Tetra Cell小型垂直電泳槽，美國BIO-RAD；Mini BIS Pro以色列DNR凝膠成像儀，以色列DNR成像系統有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 疊氮化鈉條件下體外非酶糖基化體系的建立

參照Wang等[19]的方法，稍作修改。向5 mL質量濃度為90 mg/mL的葡萄糖（Glucose，G）或果糖（Fructose，F）溶液中加入10 mL質量濃度為10.00 mg/mL的BSA溶液，混合均勻后在37 ℃條件下避光反應6個月，這期間分別在第1，第2，第3，第4，第5和第6個月取出部分樣品，暫存于-80 ℃。

1.3.2 微孔濾膜抽濾條件下體外非酶糖基化體系的建立

參照1.3.1采用微孔濾膜抽濾的方式對反應試劑滅菌。具體為，采用不含NaN3的磷酸鹽緩沖液配置反應試劑，隨后將反應試劑依次通過孔徑為0.45和0.22 μm的微孔濾膜，混合均勻后在37 ℃條件下避光反應6個月，這期間分別在第1，第2，第3，第4，第5和第6個月取出部分樣品，暫存于-80 ℃。

1.3.3 體系中AGEs含量的測定

利用熒光酶標儀在增益50，激發波長355 nm，發射波長460 nm處測定體系的熒光值。同時以磷酸鹽緩沖溶液作為空白測定空白組熒光值。

1.3.4 AGEs分子量分析

使用BCA蛋白定量測定試劑盒測定樣品的蛋白濃度，確定樣品的稀釋倍數后分別進行Native-PAGE電泳以及SDS-PAGE凝膠電泳[15,20]。

通過基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（MALDI-TOF/TOF）在正離子模式下選擇線性方法對體系蛋白分子量進行分析[20]，試驗產生的原始數據及圖譜由4000 Series Explorer V 3.5軟件導出。

1.3.5 AGEs還原糖測定

分別使用葡萄糖測定試劑盒（葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法）及Fructose Assay Kit對體系中的葡萄糖、果糖含量分別進行測定。

1.3.6 AGEs游離氨基測定

采用鄰苯二甲醛（OPA）法測定體系中游離氨基的含量[21-22]。取4.0 mL OPA試劑于試管中，加入200 μL樣品，對照組加入相同體積的蒸餾水，混合均勻后，在35 ℃水浴條件下反應2 min，隨后利用酶標儀測定體系在340 nm處的吸光度A340，以賴氨酸代替樣品采用相同方法制作標準曲線，根據曲線計算游離氨基含量。其計算公式如下：

式中：N為反應后體系游離氨基濃度；N空白為空白組中游離氨基濃度。

1.4 統計分析

所有的試驗均進行3次重復，數據均以平均值±標準偏差表示，利用Graphpad Prism 5軟件繪圖。利用SPSS Statistics 19軟件進行數據處理并檢驗數據間的差異顯著性（p＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌方式對AGEs熒光值的影響

AGEs是一類復雜的混合物，其中含有大量的具有熒光交聯性的物質，如戊糖素，因此熒光值成為AGEs量化的重要指標[9,23]。兩種還原糖與BSA在1～6個月期間產生的熒光值的變化情況如圖1所示。總體上AGE-F-BSA體系的熒光值顯著高于AGE-G-BSA體系，該結果與李曉明等[24]的結論一致，證實了果糖更容易引發牛血清白蛋白糖基化而且反應相對劇烈，可產生較多的AGEs。在AGE-G-BSA體系中，熒光值隨反應時間的延長大體呈現增長趨勢，只是第5個月時略有下降，當第6個月時MSF滅菌條件下其熒光值為132 916.67±50.00（p＜0.05），為反應1個月時的3倍以上（圖1A）。但是在AGE-F-BSA體系中，熒光值的變化與AGE-G-BSA呈現不同的趨勢，NaN3存在對其熒光值變化產生重大的影響，即無NaN3時，AGEF-BSA第3個月熒光值基本達到飽和，而NaN3存在條件下，熒光值呈現以3個月為周期的周期性變化（圖1B）。劉貴梅等[25]采用酪蛋白分別與甲基乙二醛、乙二醛在37 ℃條件下反應，結果表明兩種體系的熒光值均在反應第20天達到最大，而當反應進行到30 d時熒光值顯著減少（p＜0.05），與研究結果有相似之處。這可能與非酶糖基化反應復雜，部分反應產物在達到一定反應時間時發生了降解或熒光交聯鍵斷裂有關，具體原因還需進一步探究。

兩個AGEs體系中，NaN3與MSF相比，其熒光值普遍較低，說明NaN3部分地影響了體系中AGEs的形成。又由于當反應時間為1、3、6個月時體系的熒光值可以反映整體AGEs產生情況，在接下來的試驗中為了簡化試驗步驟，選擇了具有代表性的1、3、6個月的體系進行進一步研究。

圖1 非酶糖基化體系熒光值

2.2 不同滅菌方式對AGEs分子量的影響

AGEs的形成過程中會產生大量的交聯產物，導致分子量的增加[26-28]。用Native-PAGE（圖2A、B）及SDS-PAGE（圖2C、D）分析在不同滅菌條件下兩個體系中蛋白分子量的變化，發現三個時間段產生的AGEs與BSA相比無明顯變化，并未出現孔陽輝[26]，Kong等[29]報道中提到的97 kDa的片段。然而采用MALDITOF/TOF對蛋白分子量分析后發現，隨著反應時間的增長，體系分子量逐漸增加，增加范圍為23.36～1 765.68 Da（見表1）。Nagai等[18]報道輕度糖基化的AGEs（培養24周）和高度糖基化的AGEs（培養40周）與BSA相比蛋白分子量分別增加了658和9 389 Da，與試驗結果趨勢相似，表明隨著反應時間的推進其蛋白糖基化修飾程度也隨之增強。Annett[16]曾報道人血清白蛋白（HSA）與葡萄糖反應一個月后，其分子量與初始分子量相比增加了4 169 Da，高于試驗結果。這可能是HSA和BSA與還原糖結合的游離氨基數量不同以及結構差異，導致糖基化程度不同。有趣的是，兩個體系、兩個滅菌方式對分子量的增加均呈現不同的趨勢。具體是，AGE-G-BSA體系的分子量均高于AGEF-BSA體系的分子量，MSF滅菌組的分子量高于NaN3滅菌組的分子量。在AGE-F-BSA體系中第1個月時的分子量甚至低于BSA。Annett[16]報道中提出熒光強度較高的體系其蛋白修飾水平并不高，這一現象與試驗結果相似。這可能與非酶糖基化反應過程中不同修飾劑與蛋白間反應的比率不同有關。

2.3 不同滅菌方式對體系中還原糖含量的影響

還原糖的羰基是與蛋白的氨基結合生成熒光性AGEs的重要活性基團，在AGEs生成過程中，隨著反應時間的延長果糖參加反應不斷消耗導致果糖含量減少[30]。圖3為非酶糖基化體系中剩余葡萄糖含量的變化，AGE-F-BSA體系中剩余果糖含量與AGE-G-BSA體系中剩余葡萄糖含量趨勢基本一致，即在反應時間為1個月時，兩個體系中NaN3和MSF條件下殘留還原糖含量均約為反應初始質量濃度（30.00 mg/mL）的2%，這表明非酶糖基化反應在1個月時，其還原糖的利用已經基本達到了飽和狀態，在隨后反應時間為3、6個月的體系中，還原糖含量基本無顯著變化（p＞0.05）。這些數據表明添加NaN3并未顯著影響熒光性AGEs形成時還原糖的消耗進程。

圖3 非酶糖基化體系葡萄糖含量

2.4 不同滅菌方式對體系中游離氨基含量的影響

BSA分子結構中的游離氨基是熒光性AGEs生成所必須的活性基團，BSA濃度越高，氨基基團濃度越大，使得反應物分子之間碰撞作用逐步增大加快反應速率，導致熒光性AGEs大量積累，因此游離氨基含量的變化常被用來表示蛋白質與糖接枝反應的程度[30]。由圖4可知，隨著反應時間的延長，AGE-G-BSA體系中的游離氨基逐漸減少，當反應6個月時，其游離氨基為反應前BSA的10.3%（NaN3條件，圖4A）和6.4%（MSF條件，圖4B），而AGE-F-BSA體系中，當糖基化反應進行到第1個月時，其游離氨基為原BSA的11.4%（NaN3條件，圖4C）和10.0%（MSF條件，圖4D），之后無顯著變化，且兩種滅菌條件下其變化趨勢一致。這種變化規律也與體系熒光值的變化趨勢一致（圖1），表明游離氨基的含量與熒光性AGEs的形成進程密切相關，類似結果目前無相關報道。AGEG-BSA體系中MSF條件下的游離氨基均少于NaN3條件，說明NaN3對游離氨基的消耗有一定的制約作用。

3 結論

在1、3和6個月的BSA-還原糖非酶促反應發生過程中，AGE-G-BSA體系的熒光值逐漸增加，葡萄糖和游離氨基隨著培養時間的增加而逐漸減少；而在AGE-F-BSA體系中，MSF條件下果糖含量無明顯變化，體系的游離氨基含量在培養1個月時基本上達到最低，之后無顯著變化。對于不同滅菌方式而言，NaN3對體系產物的形成具有一定的影響，且在AGEG-BSA和AGE-F-BSA體系中表現形式并不一致。MSF滅菌方式下對反應產生的AGEs并未見明顯影響，因此研究AGEs需要考慮NaN3對AGEs形成的影響因素。試驗主要針對熒光性AGEs的特性進行研究，并未涉及非熒光性AGEs。非熒光性AGEs，如羧甲基賴氨酸（Carboxy methyl lysine，CML），是主要的AGEs組分之一，是非熒光AGEs的代表，因此有必要對其進行系統的評估，這將是下一步的研究內容。