6個紅紫芽茶14種化學成分含量測定比較

念波 ，段雙梅，石興云，馬燕，王興華，趙明 ,

1. 云南農(nóng)業(yè)大學龍潤普洱茶學院（昆明 650201）；2. 云南農(nóng)業(yè)大學云南省藥用植物生物學重點實驗室（昆明 650201）；3. 云南省德宏州茶葉技術(shù)推廣站（德宏 678400）；4. 普洱市茶葉科學研究所（普洱 665000）

花青素是在許多植物中發(fā)現(xiàn)的植物色素，包括紅葡萄[1]，漿果（藍莓、草莓、黑加侖子、越桔）[2]，茄子[3]，紫薯[4]，芙蓉花[5]，這些色素是自然界中重要的水溶性天然色素，屬于酚類化合物中的類黃酮物質(zhì)，也是形成花瓣和果實顏色的主要色素之一，可隨細胞液的酸堿改變顏色。在酸性液中偏紅，堿性液中則偏藍[6]。花青素具有很強的抗氧化[7]，清除體內(nèi)的自由基[8]，抗癌能力[9]，改善血管壁彈性，從而達到降壓功能[10]；對心血管疾病的防治有很大作用[11-12]，由于花青素對人體的潛在益處，人們對它的興趣因此增加[13]，同時花青素還是一種無毒的天然著色劑[14]，在醫(yī)藥、化妝品、食品等領(lǐng)域有著廣闊的發(fā)展空間和價值[15]。近年來花青素的營養(yǎng)、藥理等作用逐漸引起關(guān)注，具有良好的應用和開發(fā)前景。

茶樹（Camellia sinensis（L.）O. Kuntze）是山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）的多年生常綠作物。茶樹葉片顏色一般是黃綠色，但基因改變或受環(huán)境因素的影響，芽葉顏色會呈現(xiàn)紅紫色。根據(jù)茶葉花青素含量的研究發(fā)現(xiàn)芽葉紅字顏色的深淺與花青素含量的多少呈正相關(guān)：花青素含量越高，芽葉紫色程度越深[16]。紫娟在紅紫芽茶樹中具有典型代表性，并且國家林業(yè)局于2005年11月批準其為植物新品種，并授權(quán)給予保護，品種權(quán)號20050031[11]。采摘的鮮葉加工可以制成曬青或者烘青，干茶色澤為紫黑色，沖泡茶湯為淡紫色，葉底呈靛青色，香氣純正，味濃回甘[17]。根據(jù)動物試驗結(jié)果表明，紫娟綠茶降壓效果幅度35.53%，維持至20 min，高于云南大葉群體種綠茶（29.04%，1 min）。紫娟嫩稍內(nèi)含成分極其豐富，其中最突出的是花青素，據(jù)王興華等研究顯示紫娟新稍中花青素含量29.14 mg/g，是日本高花青素茶樹品種“枕佃03—1384”（花青素0.30～0.37 mg）的100倍左右[18]。因紫娟花青素含量高，利用價值高，從而得到廣泛推廣，形成較系統(tǒng)的繁育推廣技術(shù)平臺。

紅紫芽茶樹是一種稀有、獨具特色、富含高花青素的茶樹資源[19]。為充分利用紅紫芽茶樹種質(zhì)資源，試驗對思茅茶樹良種場資源圃中的紫娟和紅紫芽茶進行花青素、兒茶素等測定分析，并與紫娟茶做了比較分析，為培育優(yōu)質(zhì)茶葉品種提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品

紫娟和5個不同嫩度的紅紫芽茶鮮葉，于2016年9月采自思茅茶樹良種場資源圃，如圖1。

1.1.2 主要試劑

使用高效液相色譜測定法（HPLC）測定花青素、兒茶素、咖啡堿含量。

甲醇、乙腈（色譜純，美國TEDIA試劑公司）；沒食子酸（GA）標品、咖啡堿（CA）標品、兒茶素（C）標品、表沒食子酸兒茶素（EGC）標品、表兒茶素（EC）標品、1, 4, 6-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖（G-G）標品、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）標品、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）標品（天津一方科技有限公司）。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

粉末顏色值中L*、b*、ΔE*ab值與姜黃素類各成分的含量均呈現(xiàn)極顯著的負相關(guān)關(guān)系，a*值與姜黃素類各成分的含量均呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)關(guān)系。

高效液相色譜儀1200（美國Agilent公司）；電子分析天平AR-1140（上海奧豪斯儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-S28S（金壇市大地自動化儀器廠）；電熱鼓風恒溫干燥箱101A-2（上海市崇明實驗儀器廠）；實驗室蒸餾水機（上海和泰儀器有限公司）；高速多功能粉碎機CS-2000（武義海納電器有限公司）。

表1 試驗樣品采摘信息表

圖1 茶葉樣品圖

1.2 方法

1.2.1 HPLC法花青素測定

1.2.1.1 樣品制備

稱取磨碎茶粉0.200 g于100 mL圓底燒瓶中，加入提取液（鹽酸甲醇）20 mL，超聲振蕩30 min，在95℃水中水浴1 h，待冷卻后，過濾在25 mL容量瓶中，重復提取2次，定容至25 mL，混勻，用0.2 μm濾膜過濾，上機，進行測定。

1.2.1.2 色譜條件

參照NY/T 2640—2014植物源性食品中花青素的測定-高效液相法[8]。色譜柱，Agilent porshell 120 ECC18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；流動相A為0.1%甲酸；流動相B為0.1%甲酸和乙腈；檢測波長530 nm；流速0.8 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μ L；HPLC洗脫程序為：0～25 min，B液從12%線性梯度增加至35%；25～25.5 min，B液從35%線性梯度增加至18%；11～25 min，B液從18%線性梯度增加至60%；25～27 min，B液由60%線性梯度增加至80% B；25.5～29.5 min，B液保持在80%；29.5～29.9 min，B液由80%降低至12%；30 min程序停止；以12% B液后運行平衡6 min。

1.2.2.1 樣品制備

稱取0.50 g茶樹花茶磨碎樣品，加入2%磷酸10 mL，加入10 mL甲醇，混合靜置1 h，過濾于50 mL容量瓶，重復提取2次，定容至50 mL，混勻，用0.45 μm有機膜過濾，上機檢測，每個樣品重復提取2次，每個提取液重復測定3次。

1.2.2.2 色譜條件

參照建立的同時測定茶葉兒茶素、咖啡堿、沒食子酸方法，應用HPLC測定茶樣中兒茶素、咖啡堿內(nèi)含物的含量。色譜柱為Tskgel ODs-80TM4.6 nm×250 mm，流動相A為0.261%磷酸與5%乙腈水溶液，流動相B為0.261%磷酸與80%乙腈水溶液，柱溫40 ℃，檢測波長280 nm，進樣量2 μL；HPLC洗脫程序為：0～25 min，B液從10%線性梯度增加至75%；25.5～29.5 min，B液從75%線性梯度增加至100%；25.5～29.5 min，B液保持在100%；29.5～29.9 min，B液由100%降低至10%；30 min程序停止；以10% B液后運行平衡6 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品重復提取2次，每個提取液重復測定3次。以Mean±SD表示；應用SPSS 22進行方差分析，按照Duncan（D）進行兩兩比較，p＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 花青素的測定與比較

將提取的花青素上機檢測后，測到6個樣品中的6個花青素：天竺葵色素（Pelargonidin，Pg）、飛燕草色素（Delphinidin，Dp）、矢車菊色素（Cyanidin，Cy）、錦葵色素（Malvidin，Mv）、牽牛花色素（Petunidin，Pt）和芍藥色素（Peonidin，Pn）；檢測色譜圖如圖2，數(shù)據(jù)結(jié)果如表2和圖3。

圖2 HPLC測定花青素色譜圖

表2 樣品花青素含量測定 mg/g

圖3 花青素含量比較

分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)一芽三葉樣品中花青素含量比較為：紅紫芽3號（4.89±0.32 mg/g）顯著高于其他（p＜0.05），紅紫芽3號＞紫娟＞紅紫芽2號＞紅紫芽1號；成熟葉片中紅紫芽4號（8.54±0.10 mg/g）顯著高于紅紫芽5號（6.31±0.15 mg/g），且顯著高于一芽三葉樣品（p＜0.05）；測定發(fā)現(xiàn)矢車菊素顯著高于飛燕草色素、天竺葵色素及其他花青素。

2.2 兒茶素的測定與比較

將提取的兒茶素上機檢測后，測到了6個樣品中8個成分：表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸脂（ECG）、表兒茶素（EC）、兒茶素（C）、沒食子酸（GA）、1, 4, 6-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖（GG）和咖啡堿（CA）；高效液相色譜檢測色譜圖如圖4，檢測結(jié)果如表3、表4、圖5和圖6。

表3 樣品中兒茶素的含量測定 mg/mL

數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)一芽三葉樣品中兒茶素含量比較為：紅紫芽1號（84.18±9.58 mg/g）顯著高于其他樣品（p＜0.05），紅紫芽1號＞紫娟＞紅紫芽2號＞紅紫芽3號；成熟葉片中紅紫芽4號（44.93±2.10 mg/g）高于紅紫芽5號（39.83±3.39 mg/g），且顯著低于一芽三葉樣品（p＜0.05）；測定發(fā)現(xiàn)6個樣品兒茶素中簡單兒茶素的含量都低于酯型兒茶素含量。

圖4 HPLC測定兒茶素、GA 、GG 、CA色譜圖

圖5 兒茶素含量比較

表4 樣品GA、CA、GG含量測定 mg/g

圖6 CA、GA、GG的含量比較

結(jié)果表明，一芽三葉樣品中，紅紫芽1號的GA含量（0.93±0.06 mg/g）顯著高于其他樣品；GG含量最高的是紅紫芽3號，達（5.05±0.82 mg/g）顯著高于其他樣品（p＜0.05）；CA含量最高的是紅紫芽1號，達18.10±1.19 g高于其他樣品。成熟葉片的GA、GG、CA含量均顯著低于一芽三葉樣品（p＜0.05）。

3 討論

高效液相色譜分析表明在紅紫芽1號中沒有檢測到牽牛花色素，錦葵色素，其余紅紫芽都檢測到植物中常見的天竺葵色素（Pg）、飛燕草色素（Dp）、矢車菊色素（Cy）、錦葵色素（Mv）、牽牛花色素（Pt）和芍藥色素（Pn）6種主要的花青素，花青素單體顯著高的是矢車菊色素，在不同紫化程度中顯著增加（p＜0.05），飛燕草色素其次含量高，這可能是紅紫芽紫色加深的主要因素。

茶樹中兒茶素是主要的多酚化合物，在試驗中，紅紫芽1號總兒茶素顯著高于其他樣品（p＜0.05），而紫娟和紅紫芽2和3號沒有顯著差異，紅紫芽4和5號沒有顯著差異，這與其花青素積累多，兒茶素積累少的分布模式總體相似，部分存在差異。酯型兒茶素在紫娟和紅紫芽1、2、3號中顯著高于紅紫芽4、5號，提示紅紫芽4和5號花青素是否較多地轉(zhuǎn)化為兒茶素；而簡單兒茶素（C）整體積累較少，研究尚未闡明原因，這可能受其他調(diào)節(jié)因子的影響。

試驗表明沒食子酸含量與兒茶素含量分布模式相似，這可能表明是酯型兒茶素含量高的重要原因。咖啡堿的生物合成與花青素分布模式相似，在紫化程度高的紅紫芽茶中含量較低，這與Kerio等[20]研究相一致。縮合單寧（GG）在紅紫芽4、5、6號中含量顯著高于其他樣品，這可能為提供花青素積累存在影響。

茶葉中內(nèi)含物質(zhì)的形成與外界環(huán)境密切相關(guān)，受光照，溫度，土壤及生物脅迫等的影響，同時受結(jié)構(gòu)基因，功能基因和激素等調(diào)控，樣品采摘是在9月下旬進行，都是在一個季節(jié)完成，試驗所得數(shù)據(jù)只能代表當季，所得結(jié)論存在偶然性，應繼續(xù)分析每個季節(jié)樣品化學物質(zhì)含量，以便綜合篩選優(yōu)質(zhì)資源，同時為花青素與兒茶素積累機制提供化合物含量方面的參考數(shù)據(jù)。紅紫芽茶富含花青素，有望開發(fā)成為特種茶，因此分析同一資源圃的6個不同紅紫芽茶兒茶素、花青素和咖啡堿等化學成分含量，有望發(fā)現(xiàn)花青素含量高的優(yōu)質(zhì)紅紫芽茶樹種質(zhì)資源庫，為今后培育優(yōu)質(zhì)茶葉品種奠定良好基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

試驗測定比較6個紅紫芽茶樣品的花青素、兒茶素和咖啡堿等化合物，發(fā)現(xiàn)紅紫芽3、4和5號花青素含量顯著高于紫娟，這些紫色茶樹資源將是花青素富集的健康茶飲料的潛在原材料，具有一定開發(fā)潛力，值得繼續(xù)研究。