貝類精氨酸激酶致敏性的研究進展

趙曉涵，張江濤，李國明，朱艷，谷瑞增，魯軍

中國食品發酵工業研究院，北京市蛋白功能肽工程技術研究中心（北京 100015）

食物過敏（FA）又稱為食物變態反應，是因為人們食用某種食品或食品添加劑后引起的IgE介導或非IgE介導的異常免疫反應，從而使人體的組織系統產生多種不良癥狀。任何食物都可能誘發變態反應，各種食物和制備方法是每個群體文化特征的一部分，因此引起癥狀的主要食物因地理位置而有所不同[1]。食物過敏原指的是能引起免疫反應的食物抗原分子。幾乎所有食物過敏原都是蛋白質，大多數為水溶性糖蛋白，相對分子質量為10～70 kDa。食物過敏是一種日益引起人們重視的食品安全問題，也是兒童中最常見的慢性非傳染性疾病[2]。目前尚無治療食物過敏的方法，但在IgE介導的過敏管理方面取得令人興奮的進展，包括通過預期篩查測試，早期引入常見食物過敏原，主動耐受誘導，使用生物制劑和主動風險管理[3]。有學者開發口服（OIT），舌下（SLIT）和表皮（EPIT）免疫療法作為食物過敏的積極治療，但沒有人完成3期研究[4]。此外，在高危嬰兒中早期引入可能的食物過敏原以積極預防食物過敏將是減緩過敏率上升的重要手段[5]。雖然嚴格避免食用過敏食物是患者的最佳選擇，但食物配料的多樣化及組成的復雜性，容易發生過敏原的意外攝入和過敏反應[6]，而且患者在長期忌食過敏食物過程中，往往會導致營養缺失，容易發生病理性飲食行為，對患者及其家庭的生活質量產生重大影響[7]。目前主要研究的幾種食物過敏治療策略有望為患者提供治療或長期緩解，但只有降低或消除過敏原的致敏性才是防止食物過敏的根本解決之法。

1 貝類過敏

由于烹飪的原因，甲殼類和軟體動物這2種無脊椎動物通常被稱為貝類。甲殼類動物與蛛形綱動物和昆蟲一起統稱為節肢動物。在世界范圍內發現5萬多種活甲殼類動物，許多甲殼類動物都可以生吃或熟吃。軟體動物也是一個龐大而多樣化的群體，細分為雙殼類、腹足類和頭足類，包括近10萬種不同的物種，包括一些具有重要經濟價值的海鮮類，如貽貝、牡蠣、鮑魚和魷魚。貝類種類繁多，因其肉質肥嫩、營養豐富而深受消費者的喜歡，而且隨著貝類養殖業、物流業和冷鏈的發展，貝類逐漸成為居民食物消費的重要組成部分，且消費市場不斷擴大[8]。

貝類過敏作為食物過敏中的一種，主要是由IgE介導的體液免疫反應引起的Ⅰ型過敏反應[9]。過敏原通過攝入、吸入或接觸進入機體后，誘發B細胞產生特異性IgE抗體，IgE與肥大細胞/嗜堿性顆粒細胞結合成為致敏靶細胞。當機體再次接觸相同過敏原刺激時，過敏原就會與靶細胞上的IgE結合發生特異性反應，釋放炎癥因子作用于效應組織和器官，從而引發急性過敏反應，如哮喘、蕁麻疹、流涕等[10]。在全球范圍內，最常見的致敏貝類是蝦、蟹、龍蝦、蛤、牡蠣和貽貝。據估計，貝類過敏的患病率為一般人口的0.5%～2.5%，在中國沿海地區甚至是內陸地區，食用貝類后引起過敏反應的事件逐年增多。

不同貝類可能含有一種或多種過敏原。隨著多種新型貝類過敏原的不斷發現，已知的貝類過敏原有原肌球蛋白（TM）、精氨酸激酶（AK）、肌球蛋白輕鏈（MLC）、肌鈣結合蛋白（SCP）、血藍蛋白亞基（HCS）[11]等，因此，主要對精氨酸激酶AK過敏原進行介紹。

2 精氨酸激酶（AK）

精氨酸激酶是貝類中對熱、酸、堿均不穩定的過敏原之一，盡管已觀察到一些二聚體AK，但其通常以單體形式被發現。AK結構復雜，它由一個大的C端結構域和一個小的α螺旋形成的N端結構域組成，C端結構域與Glu合成酶的C端結構域類似，7個α-螺旋將8股串起來的反平行β-折疊包繞起來。如圖1所示。

圖1 精氨酸激酶三維結構圖

精氨酸激酶是無脊椎動物體內主要的磷酸原激酶，參與控制細胞的ATP水平，在無脊椎動物體內有調節能量代謝的作用[12]。不同貝類中，甲殼類動物如南美白對蝦、斑節對蝦、蝦蛄中含量較多；軟體動物如太平洋牡蠣、魷魚、縊蟶及蛤蜊中的相對含量則較少，說明在不同種類貝類中，AK的相對含量有較大區別[13]。精氨酸激酶在無脊椎動物中分布廣泛，生理功能相似，根據蛋白質的四級結構及相對分子量，可以將精氨酸激酶劃分為三類：單亞基精氨酸激酶，是這三類里目前研究較多的一種，如中國明對蝦、海灣對蝦、鋸緣青蟹、牡蠣中的精氨酸激酶，相對分子量約40 kDa[14-15]；雙亞基精氨酸激酶，如海參、北極貝、深海蛤蜊中的精氨酸激酶為二聚體[16-17]，其相對分子質量約80 kDa；四亞基精氨酸激酶，如環節動物，相對分子量為150～160 kDa。

泛過敏原是指具有免疫交叉反應性結構基礎的一類過敏原[18]，這些過敏原的共同特點是它們在系統進化的過程中保持著較高的序列相似性。毛海燕[19]通過RACE的方法成功克隆擬穴青蟹AK的cDNA序列，其編碼357個氨基酸，氨基酸序列分析結果表明，擬穴青蟹AK與其他甲殼類AK之間具有較高同源性，經軟件分析表明甲殼類精氨酸激酶的活性位點在271～277位（CPTNLGT）氨基酸之間[20]。過去學者對AK研究主要集中于它在機體能量代謝調節和酶學性質方面的作用，直到2001年，Binder等[21]從102份對玉米面粉蛾過敏的患者血清中發現其中5份血清具有AK的特異性IgE抗體，證明AK是引起人對玉米面粉蛾過敏的過敏原，同時指出分子量40 kDa的蟑螂精氨酸激酶與蛾類、塵螨、龍蝦、對蝦、貝類有一定免疫交叉反應，說明AK是甲殼類動物、軟體動物甚至昆蟲中的泛過敏原。然而，大多數交叉反應性研究是基于分子和免疫學發現，而不一定是基于臨床反應性[22]。盡管AK在甲殼類和軟體動物之間的交叉反應性被廣泛報道，但對其分子特性研究還很有限。對AK的分子研究表明，一些AK氨基酸序列的高同源性導致該蛋白的三級結構（蛋白折疊）具有高相似性，從而可能導致交叉反應[23-24]。精氨酸激酶作為過敏原的研究尚處于起步階段，Yu等[25]發現蝦類的新精氨酸激酶過敏原Pen m 2，與過敏血清的反應率為33%～39%，該蛋白由359個氨基酸殘基組成，廣泛存在于各種甲殼類動物中，如蝦、蟹等。García-Orozco等[26]純化太平洋白蝦的精氨酸激酶，并對其擴增測序，指出其是首次報道的太平洋白蝦過敏原，與Pen m 2有96%同源性。

3 精氨酸激酶的致敏性與抗原表位

研究表明，過敏原能夠引發過敏反應的物質基礎是抗原表位，也稱為抗原決定簇，指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團，一般位于抗原分子的表面。抗原表位能夠被特定的抗體或免疫細胞受體識別，從而引起免疫反應。貝類AK引發的過敏反應是由IgE介導產生的，因此國內外對貝類AK過敏原表位的研究主要集中于解析其IgE結合位點[27]。在食物過敏原抗原表位的研究中，一般根據表位的結構將其分為構象型（不連續型）和線型（連續型）兩種。深入研究食物過敏原抗原表位可以指導科研人員選擇有效的理化和生物方法來降低甚至消除貝類過敏原的致敏性。過敏原檢測和免疫治療都基于抗原表位，運用分子生物學、蛋白組學、免疫學等方法對過敏原中特定氨基酸殘基及其位置進行確定，將有利于過敏原檢測和免疫治療[28]。

3.1 構象表位與致敏性

構象表位是一些在一級結構中不連續但在空間上相互接近的氨基酸殘基或肽段組成的能被特異性IgE抗體識別的區域，其致敏性依賴于抗原分子的空間結構[29]。因為構象表位是通過蛋白質折疊產生，所以定位其表位具有挑戰性。某些食物過敏原經過加工處理或消化后，蛋白構象發生變化，使蛋白分子內部的表位暴露出來，從而易于體內抗體識別，或者由于構象改變產生新的抗原表位，使其致敏性升高。另一些過敏原經過蛋白變性或消化后導致部分或全部構象表位被破壞使致敏性下降甚至消失。此外，也有一些過敏原的致敏性不會因加工處理而發生明顯變化，這是因為其抗原表位既沒有被破壞也沒有新的抗原表位曝露出來[30]。

3.2 線性表位與致敏性

線性表位，也稱連續型表位，是在一級結構上連續的氨基酸殘基或肽段構成的能被抗體分子識別結合的小肽段。許多蛋白在經過加工處理后失去原有的構象結構，或是在消化后產生的小分子肽段依然具有一定致敏性，所以在食物過敏反應中有些線性表位不僅是構象表位的組成部分，也能單獨發揮作用[31]。

3.3 精氨酸激酶表位與致敏性的研究進展

Ayuso等[32]確定凡納濱對蝦中的AK（Lit v 2）過敏原的8個線性表位（AA：1～18，25～42，64～96，121～141，142～159，160～192，232～255和319～342）。Mao等[33]通過對擬穴青蟹AK的分段表達，確定2個主要抗原表位區域（AA：174～181和253～256），并且通過重疊肽庫技術確定3個線性表位（AA：127～141，141～155和21～225），對克氏原螯蝦AK、南美白對蝦AK和章魚AK的構象型抗原表位的預測，結果發現它們與擬穴青蟹AK具有相似的構象型抗原表位。楊陽[34]通過噬菌體展示技術結合重疊肽技術、細胞模型確定擬穴青蟹AK的4個線性表位：L-AK-1（AA 113～127），L-AK-2（AA 127～141），L-AK-3（AA 141～155）和L-AK-4（AA 204～218），應用噬菌體展示技術結合LocaPep軟件分析得到擬穴青蟹AK的4個構象表位：C-AK-1（D3A4K43M1A5T49-T44I7），C-AK-2（L31K33V35T32E11E18F14S34D37），C-AK-3（V177G172M173D176Q178T174L181K175L187）和C-AK-4（R202L170Y203E190P205W204L187T206Y145），擬穴青蟹AK致敏性隨空間構象的變化而變化，其分子內部的Cys201和Cys271形成的二硫鍵是維持空間構象的關鍵位點，并通過小鼠動物模型進一步探究r AK1和r AK2的致敏性，確定AK的抗原表位優勢區位于r AK1（AA：87～186）。毛海燕[19]發現擬穴青蟹AK的抗原表位以構象型為主，但血清學的Western-blotting分析證實AK中也含有線性表位。對于貝類AK的研究相對于TM而言較少且主要集中在提取純化和分子克隆方面，貝類AK抗原表位的研究處于初始階段。

不同貝類中AK蛋白結構均有所不同，利用不同加工方法或脫敏技術處理會破壞或修飾AK抗原表位，從而影響其致敏性。研究物理法（熱處理、輻照、超高壓等）、化學法（糖基化修飾、強酸、強堿、水解等）及生物法（酶解、發酵、基因突變等）的條件改變與貝類AK抗原表位關系的報道更是少之又少。對擬穴青蟹AK進行溫度穩定性試驗后發現AK為熱不穩定蛋白，隨著溫度的升高，分子內部氫鍵及次級鍵逐漸被破壞，容易形成聚合物，導致變性、沉淀，因此以構象型表位為主的AK過敏原在經過高溫處理后致敏性會顯著降低。此外，擬穴青蟹純化AK易被胃蛋白酶降解，對胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化穩定性較強，但對致敏性的影響仍需深入研究。

4 結語與展望

有研究者對蟹AK的理化性質、消化穩定性、抗原表位、致敏性及其關鍵位點等方面進行初步探索，但仍存在一些問題需要深入研究，對其他種類的貝類AK過敏原，如軟體動物AK也需進行全面分析研究，完善AK致敏性相關信息。制備高純度的精氨酸激酶對其功能分析、特異性抗體制備及免疫鑒定顯得尤為重要，只有對AK分子克隆技術進行詳細探究，獲得具有免疫活性的AK，才能加快AK檢測和治療方面研究；AK的主要表位類型是構象表位，但構象表位的研究是免疫學界的難題之一，對食物過敏原構象表位的分析多采用噬菌體展示肽庫方法，可將該方法運用到研究AK過敏原的試驗中，且隨著現代分子生物學發展，有望找到快速繪制AK過敏原結構以及構象IgE表位技術；致敏性評估包括動物和細胞模型、胃腸道消化試驗法、熱穩定性試驗法等，使用AK致敏性蛋白表位結構與致敏性評估結合的方法，分析構象變化與致敏性關系，探尋控制AK致敏性和脫敏新技術；研究不同加工方法對AK的結構及致敏性的影響，優化降低AK致敏性加工方法，開發出低致敏性甚至無致敏性的貝類食品。