食品中驢源性成分環介導等溫擴增檢測方法的建立

柳毅，尹斯雅

保定市產品質量監督檢驗所（保定 071051）

中國的養驢歷史有4 000余年[1]。驢肉具有細嫩、美味、營養價值高的特點，并具有很高的保健功能[2]，素有“天上龍肉，地下驢肉”之說[3]。2018年，被冠以“中國驢肉火燒之鄉”的河北河間，一些家庭作坊和正規企業使用價格便宜的馬肉、騾子肉及豬肉冒充價格昂貴的驢肉[4-5]。這些“假驢肉”被批量發往北京、山東等地的驢肉火燒店[4]，給驢肉的消費市場帶來負面影響。

檢測動物源性成分的方法包括傳統方法、免疫學方法、分子生物學方法。分子生物學方法是最為成熟的檢測方法，如環介導等溫擴增（LAMP）技術，它是2000年由日本Notomi等[6]研發出來的一種新的核酸擴增方法。LAMP反應結果可以直接通過肉眼進行觀察，所用設備簡單、花費少，又能滿足快速檢測的需要，在肉類摻假成分檢測中已廣泛應用[7-11]。

線粒體DNA（mtDNA）屬于高等動物中唯一的核外遺傳物質，通常利用線粒體的基因來鑒定肉類成分[12]。檢測驢源性成分的特異性靶基因主要包括：線粒體ATPase 6基因[13]、細胞色素b（Cyt b）基因[14]等。其中，針對線粒體ATPase 6基因的檢測比較廣泛。

試驗旨在開發一項新的檢測食品中驢源性成分的環介導等溫擴增技術。試驗結果可為提高驢肉制品的安全性提供一定技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

18種肉制品，包括驢肉、驢騾肉、馬肉、豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、狗肉、鴨肉、鵝肉、狐貍肉、兔肉、鴿子肉、雞肉、魚肉、鼠肉、野兔肉、駱駝肉（購自保定出入境檢驗檢疫局、保定各大超市及農貿市場，所有樣品保證質量，防止不同肉制品交叉污染）。

1.1.2 儀器與設備

PCR擴增儀（德國Biometra公司）；Nanodrop 2000分光光度計（美國Thermo scientific公司）；BINDA 2020D凝膠成像儀（北京賓達英創有限公司）；CFX96 Touch實時熒光PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.1.3 主要試劑

脫氧核糖核苷酸（dNTPs）；10×Buffer、MgSO4、100 bp DNA Ladder Marker、Bst DNA聚合酶（Large fragment）、Alu I限制性內切酶（寶生物工程（大連）有限公司）；SYBR Green I熒光染料（Invitrogen，USA）；LAMP引物、實時熒光定量PCR引物、探針（上海生工生物工程有限公司）；組織基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物基因組DNA的制備

按照離心柱型基因組DNA提取試劑盒提取動物基因組DNA。

1.2.2 LAMP的引物設計

選用驢的線粒體ATPase 6基因作為特異性基因。依照Genebank中驢的線粒體ATPase 6基因（GenBank No.X97337.1），使用blast對此序列進行同源性分析，確定其保守序列。通過使用Primer premier 5.0和DNAMAN軟件設計LAMP的特異性引物，最終在序列10 940至11 137區域處設計一套LAMP反應的引物（外引物F3和B3，內引物FIP和BIP），具體的引物信息見表1。

表1 驢肉的線粒體ATPase 6基因

1.2.3 LAMP反應特異性檢測方法建立

按試劑盒提取法提取供試動物基因組DNA作為模板，初步確定25 μL LAMP預反應體系，其成分包括：內引物FIP和BIP各0.64 μmol/L，外引物F3和B3各0.16 μmol/L，dNTPs混合液1.0 mmol/L，1×Thermopol緩沖液，MgSO416 mmol/L，Bst DNA聚合酶大片段320 U/mL，模板DNA 50 ng/μL。

LAMP反應程序為：將所需試劑依次添加到小離心管中，放入水浴鍋中，設置反應溫度62 ℃，時間60 min；80 ℃，反應5 min，終止反應。產物進行2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。根據是否產生梯度條帶判斷LAMP擴增反應的發生情況。

1.2.4 LAMP反應條件的優化

在引物特異性強的基礎上，優化反應體系及反應條件。分別對Mg2+添加量、dNTPs添加量、內外引物濃度比、Bst DNA聚合酶進行體系優化，對反應溫度進行反應條件的優化。進行3次平行優化試驗，保證試驗條件的穩定性。

1.2.5 模擬混合樣品中驢源性成分的檢測限

以純羊肉為原料，按比例摻加驢肉，其中添加的驢肉含量分別為2%，1%，0.5%，0.1%，0.01%和0.001%，對其進行LAMP的檢測分析，驗證引物體系用于模擬混合樣品檢測限。通過產物瓊脂糖凝膠電泳法、熒光可視法和沉淀可視法比較3種產物檢測方法的優越性。

1.2.6 實際樣品的檢測

利用試驗建立的LAMP方法對市售的85份熟驢肉制品進行實際樣品的檢測，并與行業標準SN/T 3730.4—2013實時熒光PCR法檢測所得數據進行對比。

2 結果與分析

2.1 特異性檢測結果

將18種動物樣品按照試劑盒方法提取DNA后，按照1.2.3體系進行LAMP擴增，進行瓊脂糖凝膠電泳，以是否產生梯度條帶判斷引物特異性。結果如圖1所示，試驗設計的驢源性引物只對驢肉和驢騾肉進行擴增，且對上述其他16個肉類樣品均無擴增。證明試驗設計的驢源性引物具有良好特異性。

圖1 凝膠電泳特異性分析

2.2 LAMP反應條件的優化結果

2.2.1 Mg2+添加量優化結果

如圖2所示，試驗選擇最適宜的Mg2+添加量4.0 μ L。

圖2 Mg2+添加量的優化

2.2.2 dNTPs添加量的優化

如圖3所示，試驗選用2.5 μL的dNTPs添加量。

圖3 dNTPs添加量的優化

2.2.3 內外引物濃度比的優化

如圖4所示，試驗選用1∶8引物濃度比。

圖4 內外引物濃度比的優化

2.2.4 Bst DNA聚合酶緩沖液添加量的優化

由圖5可知，當緩沖液添加量為0.5 μL時，擴增條帶不清晰；隨著添加量增加，特異性擴增條帶在2.0 μL時最亮且清晰；繼續增加，條帶的清晰度變暗。綜合考慮，試驗采用2.0 μL的緩沖液添加量。

圖5 緩沖液濃度的優化

2.2.5 反應溫度對LAMP反應擴增效率的影響

如圖6所示，試驗采用更為穩定的62 ℃作為反應溫度。

圖6 反應溫度的優化

2.2.6 優化后的LAMP反應體系

經過對各條件的優化試驗，試驗最終確定LAMP檢測食品中驢源性成分的反應溫度為62 ℃，反應時間60 min，最終25 μL LAMP反應體系包括：內引物FIP和BIP各0.64 μmol/L，外引物F3和B3各0.08 μmol/L，dNTPs混合液0.125 mmol/L，1×Thermopol緩沖液，MgSO416 mmol/L，Bst DNA聚合酶大片段640 U/mL，模板DNA 2 ng/μL。

2.3 模擬混合樣品中驢源性成分的檢測限

2.3.1 LAMP凝膠電泳法的檢測限

將模擬的混合樣品提取模板后進行LAMP反應，結果如圖7所示。當驢肉含量為2%～0.1%時，均出現陽性擴增；但當驢肉含量為0.01%和0.001%時，沒有出現擴增條帶。因此，LAMP檢測模擬混合樣品中驢源性成分的凝膠電泳檢測限為0.1%。

圖7 凝膠電泳法的檢測限

2.3.2 LAMP熒光可視法檢測限

將模擬的混合樣品提取模板后進行LAMP反應，結果如圖8所示。當驢肉含量為2%～0.01%時，顯示綠色熒光（圖示為無色）；但當驢肉含量為0.001%時，熒光顯示染料原本的橙色（圖示為黑色）不變。因此，LAMP檢測模擬混合樣品中驢源性成分的熒光可視法檢測限為0.01%。

2.3.3 LAMP沉淀可視法檢測限

將模擬的混合樣品提取模板后進行LAMP反應，結果如圖9所示。當驢肉含量為2%～0.1%時，可出現白色沉淀；當驢肉含量為0.01%和0.001%時，產生的微量沉淀不易被肉眼觀察到。因此，LAMP檢測模擬混合樣品中驢源性成分的沉淀可視法檢測限為0.1%。

圖8 熒光可視法檢測限

圖9 沉淀可視法檢測限

2.4 SN/T 3730.4—2013實時熒光PCR和LAMP方法對實際樣品中驢源性成分檢測結果的比較

利用已建立的LAMP方法和SN/T 3730.4—2013實時熒光PCR的2種方法對實際購買的85份樣品進行檢測。經檢測，SN/T 3730.4—2013實時熒光PCR法檢出的驢肉摻假數為4個，分別來自各小攤販的驢肉火燒和驢肉燜子。LAMP方法檢出的驢肉摻假數為5個，分別來自各小攤販的驢肉火燒和驢肉燜子。

試驗根據敏感性（Sensitivity）、特異性（Specificity）及符合率（Coincidence rate）3個指標對LAMP方法進行方法學評價。這3個指標計算公式如式（1）～（3）所示。

根據檢測結果，以SN/T 3730.4—2013檢測為標準，則85份樣品中以檢出的驢肉摻假數表示為真陽性數，即為4；相反沒有摻假的樣品數表示為真陰性數，即為81。LAMP方法檢出的驢肉摻假真陽性數為4，沒有摻假的真陰性數為80，假陽性數為1，假陰性數為0。

LAMP方法的敏感性=3/（3+0）=100%；LAMP方法的特異性=80/（80+1）=98.77%；LAMP方法的符合率=（4+80）/85=98.82%。

由此可獲得LAMP方法在試驗中的敏感性、特異性和符合率，結果匯總見表2。

表2 LAMP方法評價

3 結論

特異性引物設計是LAMP檢測方法建立的關鍵。比較篩選出檢測驢的線粒體的特異性基因，即ATPase 6基因，并針對此基因設計特異性引物。結果顯示，只有含驢源性成分的肉樣呈陽性，其他不含驢源性成分的樣品呈陰性，表明試驗所使用的引物特異性良好。

通過LAMP方法和SN/T 3730.4—2013實時熒光PCR方法對模擬混合樣品中的驢源性成分進行檢測，LAMP凝膠電泳法的檢測限為0.1%，沉淀可視法檢測限為0.1%，熒光可視法檢測限為0.01%。對85份實際樣品進行檢測，以SN/T 3730.4—2013實時熒光PCR方法為標準對LAMP方法進行評價。最終確定LAMP方法的敏感性為100%，特異性為98.77%，符合率為98.82%。

試驗建立利用LAMP檢測食品中驢源性成分的方法。方法可以準確、快速、靈敏地檢測出食品中驢源DNA，對驢制品摻偽檢測提供技術支撐和依據，并可作為市售食品中驢源性成分檢測的有效手段。