免疫親和柱法測定生濕面制品中T-2毒素含量

楊勤，況剛，周濃，陽文武

1. 重慶三峽醫藥高等專科學校（重慶 404120）；2. 重慶第二師范學院生物與化學工程學院（重慶 400067）；3. 重慶三峽學院生物與食品工程學院（重慶 404000）；4. 重慶市萬州食品藥品檢驗所（重慶 404000）

T-2毒素屬于單端孢霉烯族化合物，是鐮孢菌屬中的三線鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌和梨孢鐮刀菌的代謝產物，主要污染玉米、大麥、大米、小麥等[1]。T-2毒素的毒性大，主要危害消化系統、神經系統和生殖系統，具有致畸性和致癌性[2-3]。T-2毒素經口、皮膚、注射等接觸方式可引起造血、淋巴、胃腸組織及皮膚的損害。此外，有些地區的食管癌和大骨節病的高發病率與T-2毒素有關[4]。T-2毒素在室溫條件下相當穩定，放置6～7年或加熱至100～120 ℃ 1 h毒性不減，但用堿處理后水解成相應的醇，毒性降低[5]。對人體來說，T-2毒素的平均慢性膳食暴露數值最高的人群為學步兒童與嬰兒，最大上限值分別為64.8和62.9 ng/（kg·bw·d）[6]。此外，以色列、俄羅斯、挪威等國均規定了谷物等食品中T-2毒素的限量（100 μg/kg），而我國GB 2761—2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》中目前暫無相關要求。鑒于生濕面制品在日常生活中的重要性，對生濕面制品中T-2毒素的含量水平進行監測對確保生濕面制品安全具有十分重要的意義。

目前，T-2毒素的分析檢測方法研究主要集中在飼料、谷物、燕麥等[7-10]農產品中的檢測。關于生濕面制品中T-2毒素的檢測鮮有報道。T-2毒素的主要檢測方法有HPLC-FLD法[11-12]、氣相色譜（Gas chromatography，GC）法[13]、酶聯免疫吸附（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）法[14]及高效液相色譜-串聯質譜（High performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法等[15-16]。試驗采用操作簡便、重現性好的HPLC-FLD法測定生濕面制品中T-2毒素的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

加堿濕面6批次、未加堿濕面6批次、餃子皮5批次、餛飩皮2批次、棒棒面1批次、刀削濕面1批次、手拉濕面1批次，樣品購自重慶市東北片區（萬州區、梁平區、忠縣、開州區、云陽縣、奉節縣、巫山縣、巫溪縣、城口縣等9個區縣）不同攤位，具體見表5。

乙腈、甲醇、甲苯（色譜純，北京迪馬科技有限公司）；T-2毒素標準溶液（100 μg/mL，北京曼哈格生物科技有限公司）；1-氰酸蒽對照品（北京北納創聯生物技術研究院）；T-2毒素免疫層析親和柱（青島普瑞邦生物工程有限公司）；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Agilengt 1260高效液相色譜儀（配備熒光檢測器，美國安捷倫科技有限公司）；摩爾基因型1850C超純水機（上海摩勒科學儀器有限公司）；IKA MS3渦旋振蕩器（德國IKA公司）；Waters固相萃取裝置（美國Waters公司）；Sartorius SQP分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；BiotageTurboVap2氮吹儀（瑞典Biotage公司）：XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

提取液：甲醇-水（8∶2，V/V）。

4-二甲基氨基吡啶溶液：準確稱取12.35 mg 4-二甲基氨基吡啶于容量瓶中，精密加入38 mL甲苯溶解，即得。

1-氰酸蒽溶液：準確稱取5.37 mg 1-氰酸蒽于容量瓶中，精密加入17.9 mL甲苯溶解，即得。

1.3.2 標準溶液的配制

T-2毒素標準中間液配制：準確移取0.5 mL T-2毒素標準溶液（質量濃度為100 μg/mL）于50 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，得質量濃度為1 μg/mL的標準中間液，于4 ℃保存，有效期為3個月。

T-2毒素標準工作液配制：分別準確移取0.1，0.2，0.5，1.0和2.0 mL T-2毒素標準中間液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成質量濃度分別為10，20，50，100和200 ng/mL的系列標準工作液。

T-2毒素標準工作液的衍生：取不同濃度的標準工作液各1.0 mL，在50 ℃下用氮氣吹干，加入50 μL 4-二甲基氨基吡啶溶液和50 μL 1-氰酸蒽溶液，在渦旋混合器上混勻1 min，于50 ℃反應15 min，在冰水中冷卻10 min后取出，在50 ℃下氮氣吹干，用1.0 mL流動相溶解，待HPLC-FLD測定。

1.3.3 樣品溶液制備

提取：稱取10 g（精確到0.001 g）混合均勻的樣品于離心管中，加入適量提取液，轉移至50 mL容量瓶中，用提取液定容至刻度，混勻，渦旋振蕩提取10 min，定量濾紙過濾。移取25.0 mL濾液加入25.0 mL水稀釋混勻，經玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清，濾液備用。

凈化和洗脫：將免疫親和柱連接于玻璃注射器下，準確移取10.0 mL提取濾液，注入玻璃注射器中。調節壓力使溶液以約1 d/s的流速緩慢通過免疫親和柱，直至空氣進入親和柱中。用10 mL水淋洗親和柱，流速為2 d/s，直至空氣進入親和柱中，棄去全部流出液，抽干小柱。準確加入1.0 mL甲醇洗脫，流速約為1 d/s，收集洗脫液。

衍生：洗脫液在50 ℃下用氮氣吹干，按標準工作液的衍生步驟進行。

1.3.4 儀器條件

流動相：乙腈-水，對流動性比例進行優化。柱溫：35 ℃。流速：1.0 mL/min。進樣量：20 μL。檢測波長：激發波長381 nm，發射波長470 nm。對色譜柱進行考察。

1.3.5 方法的線性范圍、檢出限及定量限測定

按照優化的色譜條件，對衍生的標準工作液進行測定，以待測T-2毒素的峰面積（y）為縱坐標，T-2毒素的質量濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線。在空白基質中依次加入較低質量濃度的標準溶液，然后進行測定，以3倍信噪比（RS/N=3）和10倍信噪比（RS/N=10）確定方法的檢出限和定量限。

1.3.6 方法的精密度

精密吸取20 μL“1.3.2”項下衍生后的標準溶液，注入液相色譜儀，連續進樣6次，按照優化的色譜條件進行測定，記錄峰面積并計算RSD。

1.3.7 方法的穩定性

精密吸取同一份空白加標供試品溶液（加標量30.0 μg/kg），按照優化的色譜條件，分別于0，2，4，6，8，10和12 h進行測定，記錄峰面積并計算RSD。

1.3.8 方法的回收率和重復性

稱取10 g（精確到0.001 g）空白試樣，分別進行10.0，30.0和100.0 μg/kg 3個加標水平的基質加標回收試驗，每個加標水平稱取6份樣品，按“1.3.3”項下方法制備供試品溶液，并進行HPLC-FLD分析，計算測得總量、平均回收率和相對標準偏差（Relative standard deviation，RSD）。

2 結果與分析

2.1 色譜柱的考察

色譜柱的選擇對T-2毒素的分離效果影響很大。考察表1中四種色譜柱對T-2毒素分離效果的影響。結果表明，Agilent ZORBAX SB色譜柱對T-2毒素的分離效果最好（圖1D），Diamonsil、Agilent 5 TC和Inertsil ODS-SP3種類型色譜柱沒能將T-2毒素分離好（圖1A，B和C）。

表1 色譜柱型號

圖1 不同色譜柱下標準溶液色譜圖

2.2 色譜條件的優化

流動相的不同配比直接影響T-2毒素的出峰時間及分離效果。在選用Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μ m）的色譜柱條件下，考察表2中三組流動相對T-2毒素分離效果的影響。結果表明，在1組色譜條件下，T-2毒素峰分離效果理想，分離度＞1.5（圖2A），其余兩組色譜條件下T-2毒素峰與雜質峰均分離不完全（分離度＜1.5），且在1組色譜條件下空白加標樣品也可以實現較好的分離（圖2B）。

表2 流動相配比及分離效果

圖2 不同色譜條件下標準溶液和空白加標樣品色譜圖

2.3 方法的線性范圍、檢出限及定量限

用HPLC-FLD法測定時，T-2毒素在10～200 ng/mL質量濃度線性范圍內均呈良好的線性關系，r=0.999 9。當生濕面制品的稱樣量為10 g時，檢測限為10 μg/kg，定量限為30 μg/kg。結果見表3。

表3 線性關系及檢測限、定量限

2.4 方法的精密度

結果表明，T-2毒素峰面積的RSD為1.3%，說明儀器精密度良好。

2.5 方法的穩定性

結果表明，T-2毒素峰面積的RSD為2.5%，說明該供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.6 方法的回收率和重復性

HPLC-FLD法中，當生濕面制品的稱樣量為10 g時，T-2毒素在10.0，30.0和100.0 μg/kg 3個加標水平的平均回收率分別為73.4%，83.0%和94.6%，RSD分別為5.6%，4.0%和1.4%，表明該方法準確度和重復性均滿足分析要求。結果見表4。

表4 方法回收率和RSD（n=6）

2.7 樣品測定

取22批生濕面制品，按“1.3.3”項下方法制備供試品溶液，在優化所得色譜條件下進行測定，外標法定量。結果表明，22份樣品中有5批次檢出T-2毒素，但均低于檢出限。檢出T-2毒素的樣品中，有4批次是沒有加堿的樣品，另外一批樣品不確定是否加堿。結果見表5。

表5 樣品T-2毒素含量測定結果 μ g/kg

3 結論與討論

GB 5009.118—2016《食品安全國家標準 食品中T-2毒素的測定》中的色譜條件，只規定了色譜柱的長度，沒有規定色譜柱的品牌、型號，試驗通過不斷摸索，最終選取Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）的色譜柱。在此色譜柱條件下，T-2毒素峰形良好、分離效果好。此外，試驗還對T-2毒素色譜峰的出峰時間進行了調整，結果發現，當乙腈-水為78∶22（V/V）時，樣品分離效果理想（分離度＞1.5），可用于生濕面制品中T-2毒素的檢測。當生濕面制品的稱樣量為10 g時，檢測限為10 μg/kg，定量限為30 μg/kg。該方法精密度、重復性良好，且空白加標供試品溶液在12 h內穩定。生濕面制品中的T-2毒素在10.0，30.0和100.0 μg/kg 3個加標水平的平均回收率分別為73.4%，83.0%和94.6%，RSD分別為5.6%，4.0%和1.4%。通過優化樣品前處理過程和色譜條件，試驗建立了生濕面制品中T-2毒素含量的免疫親和柱-高效液相色譜熒光法的測定方法，該方法操作步驟簡便、快速靈敏、重現性好，適用于大批量生濕面制品中 T-2毒素的快速檢測。

T-2毒素性質穩定，不易分解，容易在人體內積蓄，長期食用含有T-2毒素的生濕面制品，很有可能引起身體不適，甚至會有患癌癥的風險。生濕面制品是深受廣大人民群眾喜愛的食品，男女老少皆宜，每年的消耗量巨大，而《國家食品安全監督抽檢實施細則 2019年版》中生濕面制品的檢驗項目未包含T-2毒素，為提高生濕面制品的質量，保證人民飲食安全，應盡快制定相應細則，加強對生濕面制品中T-2毒素的監控。

樣品測定中發現：加堿濕面中均未檢出T-2毒素，這是否與加堿后T-2毒素在堿性條件下分解有關，需要更進一步的研究。