山竹的花色苷、黃酮、總酚含量及其抗氧化活性

祝思宇，肖怡，陳冠林，張奎，傅南琳*

1. 廣東藥科大學附屬第一醫院（廣州 510008）；2. 佛山市職業病防治所（佛山 528000）

山竹（Garcinia mangostana L.）又名山竹子、莽吉柿、倒捻子、鳳果，為藤黃科（Guttiferae）藤黃屬（Garcinia）植物，原產于馬來西亞，現主要分布于越南、泰國、印度尼西亞、馬來西亞和菲律賓等東南亞國家以及我國廣東、海南、福建、臺灣等省[1-4]。山竹含有豐富的花色苷、黃酮、多酚、氧雜蒽酮和有機酸等化合物，從山竹中分離的化學成分約為114種[1,5-12]。在東南亞，用山竹的果皮、樹皮以及樹根作為藥材治療不同的疾病已有幾百年歷史[1]。目前已證實山竹的果皮提取物對腹痛、腹瀉、感染性創傷、痢疾、慢性潰瘍和淋病有一定的抑制作用[13-17]。在針對山竹果皮提取物的研究中，除了對山竹活性成分提取工藝[5,9-10]和提取物抗氧化活性[18-22]的研究外，也有對山竹果皮提取物的抑菌特性[23]、成分分析的研究[24]，但對于山竹提取物模擬體外消化后測定其提取物含量及抗氧化活性變化的相關研究卻未見報道。因此，此次試驗以山竹為原料，采用一定比例的乙醇提取，在不同的pH條件下應用乙酸乙酯對提取液進行萃取分離，獲得花色苷、黃酮以及多酚，測定模擬體外消化前后這些活性成分含量的變化，并系統地測定模擬體外消化后山竹各組分的抗氧化活性，為山竹的開發利用提供參考依據。

1 試驗材料

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

山竹：市售。經廣東藥科大學中藥學院中藥鑒定學系李書淵教授鑒定，為藤黃科植物山竹（Garcinia mangostana L.）的成熟果實。

1.1.2 試驗試劑

Trolox（6-hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，水溶性維生素E）、ABTS（2,2-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，2, 2’-聯氨-雙-3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）以及福林-酚試劑（Folin-Ciocalteu reagent），美國Sigma公司；TPTZ（2, 4, 6-tris-2, 4, 6-tripiridyl-2-triazine，三吡啶三吖嗪）和DPPH（1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼），阿拉丁公司；胃蛋白酶，甘氨脫氧膽酸鈉，牛磺脫氧酸鈉，牛磺膽酸鈉，美國Amresco公司；胰液素，日本TOYOBO公司；沒食子酸：購于中國藥品生物制品檢定所；氫氧化鈉、NaNO2、Al(NO3)3、FeCl3、HCl、過硫酸鉀、乙酸鈉、乙醇（分析純），天津化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

UV-9600紫外/可見分光光度計，北京瑞利分析儀器有限公司；LEO-150 S超聲清洗儀，昆山力波超聲波設備有限公司；多功能攪拌機（WBL 25 B26），美的集團有限公司；SY 2000旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ⅲ型循環水真空泵，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 樣品的制備

山竹購回后用去離子水清洗干凈，將果皮和果肉分離，切碎后用攪拌機將其分別攪拌均勻，備用。

2 方法

2.1 山竹的提取

準確稱取1.0 g攪拌均勻的山竹果皮（或果肉），加入50 mL 50%乙醇，在40 ℃下超聲10 min后抽濾，減壓濃縮后，濾液備用[25]。

2.2 山竹提取物中花色苷、黃酮和總酚的分離

將濾液用乙酸乙酯（1∶1，體積比）萃取3次，水相減壓蒸餾（50 ℃）去除有機溶劑后獲得花色苷類物質。乙酸乙酯相減壓蒸干后溶于水中，將水相的pH調至7.0，用乙酸乙酯（1∶1，體積比）萃取3次，乙酸乙酯相減壓蒸餾至干后溶于水中，獲得黃酮類物質。水相的pH調至2.0后，用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯相減壓蒸餾至干后溶于水中，獲得酚類物質[26]。

2.3 體外消化

將山竹提取物樣品轉移到棕色瓶與平衡鹽溶液混合，使其總體積為20 mL。用1 mol/L的HCl將樣品的pH調至2，加入1 mL胃蛋白酶，在37 ℃的水浴中振蕩（95 r/min）1 h，模擬胃消化；經過胃蛋白酶消化后，用0.9 mol/L的碳酸氫鈉將樣品的pH調至5.3，加入0.2 mL甘氨脫氧膽酸鈉、0.2 mL牛磺脫氧酸鈉、0.2 mL牛磺膽酸鈉和0.1 mL胰液素，再用1 mol/L的NaOH將樣品的pH調至7.4后，置37 ℃的水浴中振蕩（95 r/min）2 h，模擬腸道消化[27]。

2.4 花色苷的測定

將花色苷提取物與0.025 mol/L的氯化鉀溶液按一定的比例混勻（pH 1.0），用蒸餾水調零，分別測定其在515和700 nm下的吸光度。將花色苷提取物與0.4 mol/L的醋酸鈉緩沖液按一定的比例混勻（pH 4.5），用蒸餾水調零，分別測定其在515和700 nm下的吸光度，計算提取物的吸光度A。A=(A515-A700)pH1.0-(A515-A700)pH4.5。按以下公式計算總花色苷的含量：X（mg/L）=（A×MW×DF×1 000）/（e×1）。式中：A為樣品的吸光度；DF為稀釋倍數；MW為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質量，MW=449.2；e為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數，e=26 900[28]。

2.5 黃酮含量的測定

取0.10 mL待測樣品，加入0.3 mL 5%的NaNO3試劑中，反應6 min后，加入0.3 mL 10%的Al(NO3)3溶液，反應5 min后，加入2.0 mL 1 mol/L的NaOH，混勻，置室溫下反應20 min，于510 nm下測定吸光度。結果以蘆丁當量（Rutin equivalents，RE）表示，單位為mg RE/g WW（Wet weight）[29]。

2.6 總酚含量的測定

取0.10 mL待測樣品，加入2.50 mL Folin-Ciocalteu試劑中，反應4 min后，加入2.00 mL 75 g/L的Na2CO3溶液，置室溫下反應120 min，于760 nm下測定吸光度。結果以沒食子酸當量（Gallic acid equivalents，GAE）表示，單位為mg GAE/g WW[30]。

2.7 FRAP法測定抗氧化活性

FRAP試劑由10 mmol/L的TPTZ（溶于40 mmol/L鹽酸）、20 mmol/L的三氯化鐵和300 mmol/L的乙酸鈉緩沖液（pH 3.6）以體積比1∶1∶10混合而成。取100 μL待測樣品，加入3 mL FRAP溶液中充分混合，反應120 min后于593 nm處測定吸光度。以Trolox溶液為標樣作標準曲線，樣品的抗氧化活性用μmol Trolox/g WW表示[31-32]。

2.8 DPPH法測定抗氧化活性

取0.1 mL待測樣品，加入3.9 mL 0.06 mmol/L DPPH·80%乙醇溶液，振蕩15 s，放置暗處反應2 h后，于515 nm處測定吸光度，按公式計算清除率：清除率=（A對照-A樣品）×100%/A對照。以3.9 mL DPPH·+0.1 mL 80%乙醇作對照，空白為80%乙醇，以Trolox溶液為標樣作標準曲線，樣品的抗氧化活性用Trolox當量表示，單位為μ mol Trolox/g WW[33]。

2.9 ABTS法測定抗氧化能力

將7 mmol/L的ABTS（用pH為4.5、20 mmol/L的乙酸鈉配制）和2.45 mmol/L的過硫酸鉀等體積混合，室溫下避光反應12～16 h，形成ABTS+·儲備液。使用前用20 mmol/L乙酸鈉（pH 4.5）將ABTS+·儲備液稀釋成為工作液，使其在734 nm處吸光度為0.700±0.005。取100 μL待測樣品，加入3 mL ABTS+·工作液，室溫下反應2 h后，在734 nm處測定吸光度。以20 mmol/L乙酸鈉（pH 4.5）為空白，ABTS+·為對照，以Trolox溶液為標樣作標準曲線，樣品的抗氧化樣品的抗氧化活性用TEAC（Trolox equivalent antioxidant capacity）表示[32]。單位為μ mol Trolox/g WW。

2.10 數據分析

試驗一式三份，結果以均數±標準差表示。應用SPSS 17.0軟件對數據進行ANOVA and Tukey’s多重比較分析（Tukey’s multiple comparison tests）。以a=0.05為顯著性水平，判斷各組之間差異是否具有統計學意義。

3 結果與討論

3.1 線性關系

從表1可以看出，在測定范圍內黃酮、多酚、FRAP、DPPH以及ABTS 5種測定方法具有很好的線性關系。

表1 黃酮、多酚、FRAP、DPPH以及ABTS的線性方程、相關系數和線性范圍

3.2 山竹中花色苷、黃酮以及多酚的含量

從表2可以看出，消化前花色苷的含量為49.21 mg/L，經模擬胃腸道消化后，花色苷含量明顯下降，差異具有統計學意義（p＜0.05）。經模擬胃消化后山竹果皮和果肉的多酚含量均下降，差異具有統計學意義（p＜0.05），與蘋果、香蕉、圣女果、柑橘、葡萄、荔枝、芒果、山竹、梨、李子的研究結果一致[34]。與消化前比較，經模擬腸消化后山竹果肉多酚含量升高，差異具有統計學意義（p＜0.05），而果皮多酚含量下降，差異沒有統計學意義（p＞0.05）。經模擬胃腸道消化后，果皮和果肉黃酮含量有所升高，但差異沒有統計學意義（p＞0.05）。此次試驗中，山竹果皮的黃酮和多酚含量均較果肉高，與其他的研究結果一致[35]。陳海光等[2]研究發現，山竹果皮總酚含量為36.9 mg GAE/g FW，比此次試驗中山竹果皮和果肉總酚含量高，其原因可能是山竹品種或者產地不同因而所含總酚不同。山竹果肉的總酚含量比榴蓮、三華李、李子、楊梅、橙子、柑橘、芒果、櫻桃、棗、番石榴、柿子、石榴、以及番荔枝果肉的總酚含量低[34,36]。

3.3 山竹提取物的鐵離子還原能力

從表3可以看出，山竹各部分提取物的抗氧化能力均較強。消化前山竹果皮黃酮的FRAP值最高，其次是果皮花色苷和果皮多酚，而果肉多酚的FRAP值最低。經模擬胃消化后，果皮花色苷、黃酮和多酚的FRAP值均有所升高，差異具有統計學意義（p＜0.05）；而果肉黃酮和多酚的抗氧化能力有所下降，差異具有統計學意義（p＜0.05），這與西瓜、甘蔗、楊梅、三華李、荔枝以及龍眼的研究結果是一致的[34]。與消化前比較，經模擬胃腸消化后果皮花色苷、黃酮和多酚的抗氧化能力均增強，差異具有統計學意義（p＜0.05）；消化后山竹果皮黃酮的FRAP值最高，其次是果皮花色苷和果皮多酚。而果肉多酚的FRAP值最低，這與消化前的結果是一致的。而山竹果肉無論是消化前還是經胃腸消化后其FRAP值均較芒果、三華李以及楊梅低[34]。山竹中富含花色苷、α-mangostin、兒茶素、香草酸、對香豆酸、咖啡酸和阿魏酸等活性成分[16,24,37-41]，這些活性成分均具有較強的抗氧化能力[42-48]。研究發現，α-mangostin、咖啡酸、對香豆酸和兒茶素等活性成分對低密度脂蛋白膽固醇的氧化有很好的抑制作用[49-52]，且混合酚類對低密度脂蛋白膽固醇氧化的抑制作用更強[53]。

表2 山竹中花色苷、黃酮以及多酚的含量

表3 山竹提取物的鐵離子還原能力 μmol TE·g-1

3.4 山竹提取物的ABTS自由基清除能力

從表4可以看出，消化前山竹果皮黃酮對ABTS自由基的清除能力最高，其次是消化后花色苷和果皮多酚，而果肉多酚對ABTS自由基的清除能力最低，山竹果皮對ABTS自由基的清除能力高于果肉，這與以往的研究結果是一致的[54]。經模擬胃消化后，果皮黃酮、果肉黃酮和多酚對ABTS自由基的清除能力均有所升高，差異具有統計學意義（p＜0.05）；而果皮花色苷和多酚對ABTS自由基的清除能力有所下降，差異具有統計學意義（p＜0.05），這與楊梅、芒果和李子的研究是一致的[34]。與消化前比較，經模擬胃腸消化后果皮黃酮、果肉黃酮和多酚對ABTS自由基的清除能力均有所升高，差異具有統計學意義（p＜0.05）。消化后山竹果皮黃酮的ABTS值最高，其次是果皮花色苷，果皮多酚，而果肉多酚的ABTS值最低，這與消化前的結果是一致的。Fu等[36]研究發現，橄欖、石榴、番荔枝、番石榴、柿子和李子對ABTS自由基的清除能力較強，而香梨對ABTS自由基的清除能力較弱。此次試驗中經胃腸消化前，山竹果肉對ABTS自由基的清除能力較葡萄（綠）、葡萄（USA）、菠蘿蜜、檸檬、甜瓜、臍橙、番木瓜、百香果、香梨以及西瓜強[36]。而山竹果肉無論是消化前還是經胃腸消化后其對ABTS自由基的清除能力均較榴蓮、芒果、三華李以及楊梅弱[34]。山竹果肉有較強的ABTS自由基清除能力，其總多酚（Total polyphenols）的ABTS自由基清除能力為1 268.6 mmol TE/100 g FW（Fresh weight），而游離酚（Free polyphenols）的ABTS自由基清除能力為260.4 mmol TE/100 g FW[55]，其對ABTS自由基的清除能力較此次試驗強。另一項山竹果皮提取物對ABTS自由基清除能力的研究顯示，山竹果皮的乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物的IC50值分別為6.82，16.95，11.15，3.04，4.39和45.86 μg/mL，其中乙酸乙酯提取物對ABTS自由基的清除能力最強，但比維生素C（IC50值為2.62）弱[56]。

表4 山竹提取物對ABTS自由基的清除能力μ mol TE·g-1

3.5 山竹提取物的DPPH自由基清除能力

從表5可以看出，消化前山竹果皮黃酮對DPPH自由基的清除能力最高，其次是果皮多酚和花色苷，而果肉多酚對DPPH自由基的清除能力最低，山竹果皮對DPPH自由基的清除能力高于果肉，這與以往的研究是一致的[54]。經模擬胃消化后，果皮花色苷、黃酮、多酚，果肉黃酮和多酚對DPPH自由基的清除能力均有所升高，差異具有統計學意義（p＜0.05）。與消化前比較，經模擬胃腸消化后果皮花色苷、果肉黃酮和多酚對DPPH自由基的清除能力均有所升高，差異具有統計學意義（p＜0.05），這與蘋果、圣女果、香蕉、葡萄、芒果、山竹、梨、火龍果、西瓜等研究是一致的[34]。消化后山竹果皮花色苷的DPPH值最高，其次是果皮黃酮和果皮多酚，而果肉多酚的DPPH值最低，這與消化前的結果是一致的。山竹果皮中的化學成分α-mangostin、γ-mangostin、gartanin、garcinone D和6-methoxy-bis pyrano xanthone均具有較強的DPPH自由基清除能力，其IC50值分別為35.03，21.52，25.61，73.79和48.67 μg/mL，但山竹中的mangostanate不具有清除DPPH自由基的能力[57]。另一研究發現，山竹水提物和α-mangostin呈濃度依賴性地抑制DPPH自由基的活性，其IC50值分別為54.37和183.95 mg/mL，山竹水提物對DPPH自由基的清除能力更強[58]。從山竹果皮分離的Mangostanaxanthones I和Mangostanaxanthones II也具有較強的DPPH自由基清除能力，其IC50值分別12.07和14.12 μmol/L[59]。研究發現，γ-mangostin具有減弱叔丁基過氧化氫（t-BHP）誘導肝細胞損傷的活性，可顯著改善t-BHP誘導活性氧的積累，以及線粒體膜去極化和肝細胞（HL-7702）細胞核形態的改變，同時還可以逆轉由t-BHP所引起的谷氨酸丙酮酸轉氨酶和谷氨酸草酰乙酸轉氨酶的降低。此外，γ-mangostin還能顯著降低脂質過氧化物的水平，增加還原型谷胱甘肽和超氧化歧化酶的水平，從而減輕氧化應激[56]。

表5 山竹提取物對DPPH自由基的清除能力μmol TE·g-1

4 結論

研究采用DPPH、ABTS和FRAP三種方法分別測定了模擬胃腸消化前后山竹提取物的抗氧化活性，并用示差法、福林-酚法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法測定了花色苷、總酚和黃酮含量。結果表明，山竹提取物表現出不同的抗氧化活性，其中山竹果皮黃酮組分的抗氧化活性最強。