GPC-UPLC-MS/MS法測定植物油中的黃曲霉毒素

馬作江，黃山，楊迪，謝義梅，單長海，蔡學

國家富硒產品質量監督檢驗中心，恩施土家族苗族自治州公共檢驗檢測中心（恩施 445000）

黃曲霉毒素（Aflatoxins）是目前為止所發現的毒性最大的真菌毒素，通過多種途徑污染食品、糧油、飼料等，嚴重威脅人類健康[1-2]。目前已經發現的黃曲霉毒素有20余種，其中分布最廣的是黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2[3]，其結構穩定、含量低、要求相關檢測方法特異性強、靈敏度高。黃曲霉毒素的檢測方法主要有薄層色譜法[4]、高效液相法[5-6]、酶聯免疫吸附法[7]、液相色譜-質譜聯用法[8-9]。液相色譜-質譜聯用法是痕量組分定量分析的重要手段，具有高選擇性和高靈敏度的優點，但對復雜基質樣品的前處理要求較高。

黃曲霉毒素提取凈化的常規方法主要有免疫親和柱凈化法[10]、固相萃取凈化法[11]、薄層分離法等[4]。這些方法操作程序較為復雜、自動化程度不高，重現性、精密度等完全依賴操作人員的水平，對分析人員的要求較高。由于植物油等復雜樣品中色素和油脂等物質含量較高，對后續的分析工作產生較大的干擾，這就對樣品中目標化合物的提取和凈化提出了更高的要求。相比于傳統的凈化手段，凝膠色譜凈化（Gel Permeation Chromatography GPC）是基于目標物分子大小的一項分離技術，被廣泛用于殘留分析中樣品的凈化[12-13]，具有凈化容量大、可重復使用、適用范圍廣、自動化程度高等特點，尤其在富含脂肪、色素等大分子的植物油等樣品分離凈化方面，具有明顯的凈化效果。試驗研究了提取植物油樣品中黃曲霉毒素殘留的GPC前處理方法及儀器分析條件，建立了凝膠色譜凈化-超高效液相色譜-串聯質譜法測定植物油中四種黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃曲霉毒素Aflatoxin B1、Aflatoxin B2、Aflatoxin G1、Aflatoxin G2（純度≥98%），First Standard公司；黃曲霉毒素同位素內標物13C17-Afatoxin B1、13C17-Afatoxin B2、13C17-Afatoxin G1、13C17-Afatoxin G2（純度≥98%），ISOREAG公司；乙腈（LC-MS級）、乙酸乙酯（色譜純）、環己烷（色譜純），美國MREDA公司；甲酸（LC-MS級），美國Fisher公司；超純水為Milli-Q純水機制備所得；0.22 μm微孔濾膜，美國Ameritech公司。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜-串聯四極桿液質聯用儀Agilent 1290/6460 UPLC/MS/MS，配有電噴霧離子源（ESI）及MassHunter工作站數據系統數據處理系統，美國Agilent公司；氮氣發生器NM32LA，英國PEAK公司；全自動凝膠色譜凈化濃縮聯用儀The FREESTYLETMGPC-EVA，德國LC-Tech公司；氮氣吹干儀N-EVAP-112，美國Organomation公司；分析天平Quintix 224-1cn，德國賽多利斯公司；Milli-Q Integral5純水/超純水一體化系統，德國Merck Millipore公司；超聲波清洗機SB25-12D，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗條件

1.3.1 試劑的配制

混合標準及內標工作液：分別用乙腈將黃曲霉毒B1、黃曲霉毒B2、黃曲霉毒G1、黃曲霉毒G2標準物質儲備溶液（100 μg/mL）稀釋至質量濃度100 ng/mL，將黃曲霉毒素B1內標物、黃曲霉毒素B2內標物、黃曲霉毒素G1內標物、黃曲霉毒素G2內標物儲備溶液（0.5 μg/mL）稀釋至質量濃度50 ng/mL，在-20 ℃下避光保存，備用；使用時用50%乙腈配制成不同濃度標準系列工作溶液（同位素內標質量濃度為2.0 ng/mL）。

1.3.2 凝膠色譜凈化條件

GPC凝膠色譜凈化柱（20 mm×400 mm）填料：50.0 g Bio-Beads S-X3（Bio-Rad）中性、多孔的聚苯乙烯-二乙烯基苯微球體200～400目。流動相：環己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）。GPC泵流速：5.0 mL/min。樣品定量環：5 mL。Forerun（除雜質時間）：0～25 min。Mainrun（收集目標物時間）：15 min。Tailing（洗柱時間）：5 min。將收集的流分再經Online EVA自動濃縮定容系統真空濃縮，溫度40 ℃，2.0 mL定容，第一步濃縮的真空度為180 mbar，第二步濃縮的真空度為200 mbar。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18型（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）。流動相A，0.1%甲酸溶液；流動相B，乙腈；梯度洗脫見表1。柱溫：30 ℃。進樣量：2.0 μL。流速：0.3 mL/min。

1.3.4 質譜條件

離子源：電噴霧離子源ESI。掃描方式：正離子模式掃描。檢測方式：多重反應監測（MRM）。干燥氣溫度（Gas Temp）：325 ℃。干燥氣流速（Gas Flow）：5 L/min。霧化器壓力（Nebulizer）：45 psi。鞘氣溫度（Sheath Gas Temp）：325 ℃。鞘氣流速（Sheath Gas Flow）：11 L/min。毛細管電壓（Capillary）：4 000 V。高純氮氣：純度不低99.999%。采用MRM模式內標法定量，具體參數見表2。

1.3.5 樣品預處理及樣品測定

取2.5 g植物油樣品于25 mL比色管中，加入0.10 mL混合同位素內標工作溶液，用乙酸乙酯-環己烷（1∶1，V/V）混合溶液定容至刻度，渦旋混勻1.0 min，取10 mL混合提取液至GPC進樣瓶，上樣5.0 mL，GPC凈化。將收集的凈化濃縮液經氮吹儀氮吹至近干，用1.0 mL乙腈50%溶液充分溶解，混勻后過0.22 μm有機相濾膜過濾入進樣瓶，供液質聯用儀，上機，并采用MassHunter工作站數據處理系統軟件對所采集的數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 GPC凈化條件的優化

GPC凈化步驟的收集流分時間主要考慮能有效除去樣品中的色素、脂肪等大分子雜質并有效收集目標化合物。試驗用乙酸乙酯-環己烷（1∶1，V/V）混合溶液配制了質量濃度為50 ng/mL的黃曲霉毒素及其同位素內標物混合溶液，采用GPC泵，于流速5.0 mL/min洗脫，檢測黃曲霉毒素及其同位素內標物混合溶液在不同流出時間的收集液，收集每10 mL流出液于單個樣品瓶中，共收集100 mL。分別檢測各段流出液中各個目標物的含量和回收率，最終確定GPC洗脫程序：除雜質時間0～25 min；收集目標物時間15 min；洗柱時間5 min。按此洗脫程序收集并濃縮后上機檢測，結果顯示四種黃曲霉毒素的回收率均大于90%，以此確定樣品前處理為GPC方法。

2.2 色譜與質譜條件的選擇

四種黃曲霉毒素及其內標物的分子結構差異不大，采用等度洗脫很難在短時間內達到分離。用Agilent ZORBAX SB-C18型（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），并分別使用不同試劑及洗脫梯度分離黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2及其內標化合物，結果顯示，以0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動相梯度洗脫，可以使待測組分在4.5 mi內實現有效分離。

采用正離子電噴霧模式（ESI+），首先對黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合標準溶液進行全掃描（Scan），分別找到4種黃曲霉毒素及4種同位素內標物的母離子，再選擇離子檢測（SIM）確定各種目標物的保留時間、優化提取電壓（Fragmentor），然后通過子離子掃描方式（Product Ion Scan）找出各種目標物的子離子，找到其豐度較大的子離子，進一步優化碰撞能量（CE），以得到最佳的子離子用于定量，建立的MRM分析方法條件見表2。4種黃曲霉毒素及其同位素內標物的定量離子對串聯質譜圖（MRM）見圖1。以多重反應監測（MRM）的掃描模式進行檢測。

2.3 方法的標準曲線、檢出限、回收率及精密度

對四種黃曲霉毒素混合標液進樣測定，繪制標準工作曲線。并根據標準工作曲線最低濃度點的響應值進行推算，當信噪比S/N=3時對應的目標化合物含量為方法的定性檢出限（LOD）。分別稱取6份空白植物油樣品，每份2.5 g，每2份為一組，進行10.0，40.0和80.0 μg/kg三組濃度水平的添加回收試驗，重復6組平行試驗，再分別加入0.1 mL混合同位素內標物質，按方法進行測定并計算4種黃曲霉毒素的回收率和相對標準偏差（RSD）。結果見表3。

圖1 黃曲霉毒素總離子TIC圖及其各個物質的MRM圖

表3 線性方程、相關系數、檢出限、回收率及精密度

2.4 樣品測定

國內外對食品中黃曲霉毒素限量標準日趨嚴格，我國食品衛生標準GB 2761—2017規定了食品中黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素M1最大限量標準，其中植物油黃曲霉毒素B1限量為：花生油和玉米油≤20 μg/kg，其他油脂≤10 μg/kg。美國、加拿大、日本等國家主要對黃曲霉毒素（B1+B2+G1+G2）總量有限定[14]。采用此次試驗建立的檢測方法對20份菜籽油、花生油、玉米油、大豆油等植物油樣品進行檢測，其中有一份樣品檢出黃曲霉毒素B1、B2，含量分別為1.85和4.32 μg/kg，其他樣品均未檢出（小于檢出限），并對該陽性樣品采用GB 5009.22方法進行了方法驗證，檢出黃曲霉毒素B1、B2含量分別為1.60和3.08 μg/kg。結果顯示該法檢出黃曲霉毒素B1、B2含量高于GB 5009.22方法檢出含量，圖2分別為該方法（A）及GB 5009.22方法（B）檢測陽性樣品的總離子流TIC圖。

圖2 該方法（A）及GB 5009.22方法（B）檢測陽性樣品的總離子流TIC圖

3 結論

為了更有效對食品中黃曲霉毒素污染進行監測，進一步提高黃曲霉毒素的檢測手段至關重要。試驗采用凝膠色譜凈化對植物油樣品進行前處理，建立了凝膠色譜凈化-超高效液相色譜-串聯質譜聯用（GPCUPLC-MS/MS）測定植物油中四種黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量的分析方法，在質譜的正離子模式下監測，四種黃曲霉毒素及其內標化合物在4.5 min內達到有效分離，再利用同位素內標法對其定性定量分析，加標回收率大于90%，采用該法對陽性樣品進行檢測及并用國標方法進行驗證。該方法具有簡便靈敏、準確快速、重現性好、自動化程度高、雜質干擾少等優點，為植物油及其他食品中微量真菌毒素的檢測及標準制修訂等提供科學參考。